几丁质酶测定试剂盒

几丁质酶测定试剂盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。



测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。

测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨ji苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、甲苯（土壤样品专用）和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体105mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。（若出现结晶，可80℃左右加热溶解后使用）
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2.真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
3.培养液：直接测定。

测定操作表：

	对照管	测定管
粗酶液（µL）	80	80
提取液（µL）	120	40
试剂一（µL）		80
混匀，37℃水浴1h
试剂二（µL）	40	40
混匀，沸水浴7min，5000rpm，4℃，离心10min，取上清200µL。
试剂三（µL）	40	40
试剂四（µL）	80	80
混匀，37℃，15min，于微量石英比色皿/96孔板，测定A585，ΔA=A测定-A对照。

几丁质酶测定试剂盒
计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.3088-0.003，R2=0.9995
计算公式：
1、按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=8.096×（ΔA +0.003）÷W
2、按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T          
= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr
3、按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=8.096×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=8.096×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.1544x-0.003，R2=0.9995
计算公式：
4、按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.1544×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=16.192×（ΔA +0.003）÷W
5、按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T          
= 16.192×（ΔA +0.003）÷Cpr
6、按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=16.192×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=16.192×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL

注意事项：
1、反应结束后立即进行比色。
2、试剂四有一定的毒性，请操作时做防护措施。