6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶6PGDH测试盒

6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶6PGDH测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。

测定原理：
6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm吸光度增加速率，计算6PGDH活性。

自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、酶标仪、96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体19mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。

粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。


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6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶6PGDH测试盒
测定操作：
1. 酶标仪预热30min，调节波长到340 nm。
2将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3. 取96孔板，依次加入10μL样本190μL试剂一，于340nm处测定3min内吸光值变化，第10 s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A=A2-A1
注意：空白管只需要做一次。

计算公式：
使用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）6PGDH活力的计算:
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=2143.6×ΔA
2、组织、细菌或细胞中6PGDH活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2143.6×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2143.6×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
6PGDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=1.072×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。