Ca++ Mg++- ATP酶活性测定试剂盒

Ca++ Mg++- ATP酶活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
Ca++ Mg++-ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理：
根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。

需自备的仪器及用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
提取液： 液体50mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1mL蒸馏水，现用现配；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂九：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂十 20倍稀释，即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配的定磷剂应为浅。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

	对照管	测定管
试剂一（μL）	130	90
试剂二（μL）	40	40
试剂三（μL）	40	40
试剂四（μL）	40	40
试剂五（μL）		40
样本  （μL）		200

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

试剂六（μL）	50	50
样本 （μL）	200

混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3定磷（1.5mLEP管中依次加入下列试剂）

	空白管	标准管	对照管	测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸馏水（μL）	100
定磷试剂（μL）	1000	1000	1000	1000

混匀，室温放置30 min，在 660nm处比色。

注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管只能测 24份Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。

Ca++ Mg++- ATP酶活性测定试剂盒
计算：
1、血清（浆）Ca++ Mg++-  ATPase活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力（μmol /h/ mL）=[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
组织中Ca++ Mg++-  ATPase的计算： 
2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++-  ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（V样×Cpr）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.5mL；V样：加入样本体积，0.2mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。