柠檬酸合酶citrate synthase，CS试剂盒

 
柠檬酸合酶citrate synthase，CS试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
 
测定意义： 
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在於動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸迴圈個限速酶，是三羧酸迴圈主要調控位點之一。

测定原理：
CS催化乙醯CoA和草醯乙酸產生檸檬醯輔酶A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特徵吸光值。

自备仪器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水



试剂组成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體1mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體55mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入2.4mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g，4℃離心5min。
③棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④上清液即胞漿提取物，可用於測定從線粒體洩漏的CS（此步可選做）。
⑤在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於線粒體CS測定。

測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定
（1）在試劑五中加入1.2mL無水乙醇和26mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）孵育5min；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反復凍融；
（2）測定管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑五和40μL試劑六，混勻，37℃反應15min後立即測定吸光值A1。
（3）對照管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑四和40μL試劑六，混勻，37℃反應15min後立即測定吸光值A2。
（4）計算ΔA=A1-A2，每個測定管設一個對照管。

柠檬酸合酶citrate synthase，CS试剂盒
CS活性計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA
V反總：反應體系總體積，9.6×10-4 L；ε：TNB摩爾消光係數，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本品質，g；500：細胞或細菌總數，500萬。