胃蛋白酶Pepsin试剂盒

胃蛋白酶Pepsin试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：                           
胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。

测定原理：
胃蛋白酶可催化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。

自备仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入25 mL试剂二充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入25 mL蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入30 mL蒸馏水充分溶解。
试剂六：液体5mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1.26mL×1支，0.5 μ mol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。

粗酶液提取：
组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：
1.分光光度计预热30min，调节波长到580 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。
3. 标准管：取玻璃比色皿，加入100μL标准品，200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A标准管。
4. 空白管：取玻璃比色皿，加入100μL蒸馏水，200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A空白管。
5. 对照管：取EP管，加入500 μL蒸馏水，置于37℃水浴保温10min；加入500μL试剂四，盖紧后摇匀1min；加入100μL粗酶液，混匀后8000g 4℃离心10分钟取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A对照管。
6. 测定管：取EP管，加入100μL粗酶液，500 μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入500μL试剂四，盖紧后摇匀1min；8000g 4℃离心10分钟取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL试剂二，600μL试剂五，100μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A测定管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。

胃蛋白酶Pepsin试剂盒
计算公式：
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T=5500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
C标准品：标准品浓度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀释倍数：（100+500+500）÷100=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反应时间（min），10min。
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=5500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C标准品：标准品浓度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀释倍数：（100+500+500）÷100=11；W：组织质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL= 0.1 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

注意事项
试剂三、试剂四、试剂五临用前配制，配制用不完的试剂4℃可保存一周。