RNA酶去除剂

RT-PCR原理与实验技术

PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。 RT－PCR步骤： 1、RNA的提取

手把手教你如何提取 RNA？

的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase 完全失活。 1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备 RNA 时必须戴手套。 2.RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC 配制的 70% 乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明 RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常

探针的纯化

某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。 为将掺入并结合到cDNA，cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。 乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。 核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚，氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。