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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pET22b-EBFP
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pET22b-EBFP大肠荧光质粒
别称: pET22b-EBFP
质粒属性
质粒简介
pET22b-EBFP大肠蓝色荧光分泌表达质粒
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6177 bp ds-DNA circular SYN 16-MAY-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
KEYWORDS pET22b-EBFP全序列
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 6177)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Monday, September 5, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6177
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
rep_origin 12..467
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
promoter 494..598
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
CDS 599..1459
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
rep_origin 1630..2218
/direction=RIGHT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
misc_feature 2404..2546
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
CDS complement(2648..2839)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
CDS complement(3648..4730)
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
promoter complement(4731..4808)
/gene="lacI"
/note="lacI promoter"
promoter 5117..5135
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 5136..5160
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
RBS 5175..5197
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
CDS 5205..5270
/codon_start=1
/gene="pelB (fragment)"
/product="leader peptide for secretion"
/note="pelB signal sequence"
/translation="MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA"
CDS 5298..6014
/codon_start=1
/product="enhanced blue variant of GFP"
/note="EBFP"
/note="mammalian codon-optimized"
/translation="MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTL
KFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDD
GNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIK
VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLL
EFVTAAGITLGMDELYK"
CDS 6021..6038
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
terminator 6105..6152
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
ORIGIN
1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg
61 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc
121 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg
181 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc
241 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt
301 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc
361 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta
421 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt
481 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta
541 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat
601 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt
661 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg
721 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga
781 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg
841 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt
901 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg
961 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg
1021 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga
1081 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc
1141 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc
1201 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc
1261 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg
1321 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac
1381 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc
1441 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt
1501 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac
1561 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa
1621 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc
1681 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt
1741 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg
1801 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc
1861 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt
1921 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga
1981 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct
2041 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg
2101 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca
2161 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa
2221 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt
2281 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga
2341 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga
2401 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg
2461 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat
2521 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct
2581 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct
2641 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct
2701 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt
2761 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg
2821 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa
2881 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc
2941 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa
3001 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta
3061 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg
3121 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag
3181 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac
3241 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca
3301 cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg
3361 gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc
3421 cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg
3481 gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca
3541 tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag
3601 atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt
3661 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag
3721 gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc
3781 tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc
3841 cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct
3901 tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta
3961 atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg
4021 atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct
4081 tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga
4141 cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc
4201 aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg
4261 ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct
4321 tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt
4381 tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc
4441 gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc
4501 gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc
4561 gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact
4621 ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga
4681 taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc
4741 ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg
4801 atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag
4861 tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc
4921 gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat
4981 gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc
5041 aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat
5101 ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc
5161 cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa tacctgctgc
5221 cgaccgctgc tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc atggatatcg
5281 gaattaattc ggatccgatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca
5341 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg
5401 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc
5461 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacccacgg cgtgcagtgc ttcagccgct
5521 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc
5581 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt
5641 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg
5701 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcatgg
5761 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg
5821 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc
5881 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga
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6001 acgagctgta caagctcgag caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag
6061 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg
6121 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pET22b-EBFP大肠荧光质粒
别称: pET22b-EBFP
| 启动子: | T7 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 终止子: | T7 terminator |
| 质粒大小: | 6177bp |
| 质粒标签: | N-pelB，EBFP，C-6×His |
| 原核抗性: | Amp |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | BL21(DE3) |
| 培养条件: | 37℃，有氧，LB |
| 诱导方式: | IPTG或乳糖及其类似物 |
| 5'测序引物: | T7:TAATACGACTCACTATAGGG |
| 3'测序引物: | T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG |
| 备注: | 分泌表达 |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： | 蓝色 |
质粒简介
pET22b-EBFP大肠蓝色荧光分泌表达质粒
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6177 bp ds-DNA circular SYN 16-MAY-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
KEYWORDS pET22b-EBFP全序列
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 6177)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Monday, September 5, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6177
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
rep_origin 12..467
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
promoter 494..598
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
CDS 599..1459
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
rep_origin 1630..2218
/direction=RIGHT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
misc_feature 2404..2546
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
CDS complement(2648..2839)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
CDS complement(3648..4730)
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
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ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
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promoter 5117..5135
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/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 5136..5160
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/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
RBS 5175..5197
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
CDS 5205..5270
/codon_start=1
/gene="pelB (fragment)"
/product="leader peptide for secretion"
/note="pelB signal sequence"
/translation="MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA"
CDS 5298..6014
/codon_start=1
/product="enhanced blue variant of GFP"
/note="EBFP"
/note="mammalian codon-optimized"
/translation="MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTL
KFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDD
GNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIK
VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLL
EFVTAAGITLGMDELYK"
CDS 6021..6038
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
terminator 6105..6152
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
ORIGIN
1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg
61 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc
121 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg
181 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc
241 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt
301 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc
361 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta
421 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt
481 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta
541 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat
601 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt
661 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg
721 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga
781 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg
841 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt
901 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg
961 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg
1021 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga
1081 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc
1141 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc
1201 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc
1261 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg
1321 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac
1381 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc
1441 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt
1501 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac
1561 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa
1621 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc
1681 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt
1741 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg
1801 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc
1861 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt
1921 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga
1981 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct
2041 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg
2101 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca
2161 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa
2221 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt
2281 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga
2341 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga
2401 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg
2461 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat
2521 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct
2581 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct
2641 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct
2701 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt
2761 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg
2821 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa
2881 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc
2941 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa
3001 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta
3061 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg
3121 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag
3181 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac
3241 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca
3301 cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg
3361 gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc
3421 cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg
3481 gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca
3541 tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag
3601 atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt
3661 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag
3721 gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc
3781 tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc
3841 cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct
3901 tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta
3961 atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg
4021 atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct
4081 tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga
4141 cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc
4201 aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg
4261 ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct
4321 tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt
4381 tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc
4441 gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc
4501 gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc
4561 gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact
4621 ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga
4681 taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc
4741 ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg
4801 atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag
4861 tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc
4921 gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat
4981 gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc
5041 aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat
5101 ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc
5161 cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa tacctgctgc
5221 cgaccgctgc tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc atggatatcg
5281 gaattaattc ggatccgatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca
5341 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg
5401 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc
5461 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacccacgg cgtgcagtgc ttcagccgct
5521 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc
5581 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt
5641 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg
5701 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcatgg
5761 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg
5821 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc
5881 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga
5941 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg
6001 acgagctgta caagctcgag caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag
6061 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg
6121 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat
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质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P4213/pCMV-SPORT6-SIPA1人源基因质粒 |
| P4214/pCMV-SPORT6-APIP人源基因质粒 |
| P4215/pCMV-SPORT6-RNPC3人源基因质粒 |
| P4216/pCMV-SPORT6-KRAS（1点突变）人源基因质粒 |
| P4217/pCMV-SPORT6-P4HB人源基因质粒 |
| P4218/pCMV-SPORT6-IL1B人源基因质粒 |
| P4219/pCMV-SPORT6-DDIT4L人源基因质粒 |
| P4220/pCMV-SPORT6-ALG11人源基因质粒 |
| P4221/pCMV-SPORT6-ALDH3B1人源基因质粒 |
| P4222/pCMV-SPORT6-PHGDH（1同义突变）人源基因质粒 |
| P4223/pCMV-SPORT6-PRCC（1点突变）人源基因质粒 |
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文献和实验相关实验
明显现色，不过那一次的二抗用的比较多，出现了一些非特异的显色。 再往后我做分泌表达，使用的是pet22b载体，pelB信号肽引导分泌，目的基因克隆于NcoI和BamHI之间。诱导表达后检测发现表达量明显上升，可是目标蛋白的分子量却变成了21kd左右，比单独表达带大2kd左右，正好是pelB 22aa的分子量大小，表明信号肽序列没有被切除，周质蛋白分析没有发现目标蛋白，这几乎证明了我的蛋白没有分泌出来。接下来，我作了表达条件的优化，包括iptg，温度（最低到了25度）,时间等，结果仍然没有改善
pET22b 大肠杆菌质粒 Amp pET23a 大肠杆菌质粒 Amp pET24a 大肠杆菌质粒 Kan pET25b 大肠杆菌质粒 Amp
b PET15b PET16b PET17b PET19b PET20b PET21b PET22b PET23a PET24a PET25
pET22b-EBFP大肠荧光质粒
￥100 - 1000
