pET-9a大肠表达质粒

基本信息
名称：pET-9a大肠表达质粒
别称: pET5b

启动子:	T7
复制子:	pBR322
终止子:	T7 terminator
质粒分类:	大肠系列质粒；大肠表达质粒；pET系列质粒
质粒大小:	4130bp
质粒标签:	N-T7
原核抗性:	Amp
克隆菌株:	DH5a
培养条件:	37度
表达宿主:	BL21(DE3)等大肠杆菌
培养条件:	37℃，有氧，LB
诱导方式:	无需诱导，组成型表达
5'测序引物:	T7（TAATACGACTCACTATAGGG）
3'测序引物:	Amp-R（CACATTTCCCCGAAAAGTGC）
备注:	组成型表达

质粒属性

载体宿主：	大肠杆菌
载体用途：	蛋白表达
基因种属：	空载体
基因类型：	ORF
原核抗性：	Amp
真核抗性：
荧光蛋白：

质粒简介
 pET-5b质粒是一种原核表达载体，含有一个N端的T7标签和BamHI限制性内切酶位点。表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导，目的基因被克隆到质粒载体上，受噬菌体强转录及翻译信号控制。pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能最强大的系统，也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。该系列质粒能很容易的通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。

质粒图谱


质粒序列
LOCUS       Exported                4130 bp ds-DNA     circular SYN 20-09-2016
DEFINITION  synthetic circular DNA
ACCESSION   .
VERSION     .
KEYWORDS    Untitled 2
SOURCE      synthetic DNA construct
  ORGANISM  synthetic DNA construct
REFERENCE   1  (bases 1 to 4130)
  AUTHORS   .
  TITLE     Direct Submission
  JOURNAL   Exported 2016-9-20 from SnapGene Viewer 2.8.1
            http://www.miaolingbio.com
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..4130
                     /organism="synthetic DNA construct"
                     /mol_type="other DNA"
     CDS             complement(12..44)
                     /codon_start=1
                     /product="leader peptide from bacteriophage T7 gene 10"
                     /note="T7 tag (gene 10 leader)"
                     /note="promotes efficient translation in E. coli"
                     /translation="MASMTGGQQMG"
     RBS             52..74
                     /note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
                     T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
     promoter        complement(106..124)
                     /note="T7 promoter"
                     /note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
     CDS             1685..1876
                     /codon_start=1
                     /gene="rop"
                     /product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
                     number"
                     /note="rop"
                     /translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
                     DELYRSCLARFGDDGENL"
     misc_feature    1978..2117
                     /note="bom"
                     /note="basis of mobility region from pBR322"
     rep_origin      complement(2303..2891)
                     /direction=LEFT
                     /note="ori"
                     /note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
                     replication"
     CDS             complement(3062..3922)
                     /codon_start=1
                     /gene="bla"
                     /product="beta-lactamase"
                     /note="AmpR"
                     /note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
                     related antibiotics"
                     /translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
                     ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
                     PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
                     EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
                     LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
                     LIKHW"
     promoter        complement(3923..4027)
                     /gene="bla"
                     /note="AmpR promoter"
ORIGIN
        1 ttcggatccc gacccatttg ctgtccacca gtcatgctag ccatatgtat atctccttct
       61 taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg gtctccctat agtgagtcgt
      121 attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca
      181 ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc
      241 gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg
      301 tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc
      361 tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc
      421 gtcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca
      481 tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc
      541 cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg
      601 gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc
      661 ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc
      721 tgggctacgt cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc
      781 ttctcgcttc cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag
      841 atgacgacca tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga
      901 tcattggacc gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt
      961 tggcatggat tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg
     1021 catggagccg ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac
     1081 cactccaaga attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc
     1141 ttggcagaac atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg
     1201 cagcgttggg tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct
     1261 aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg
     1321 aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt
     1381 ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat
     1441 ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg
     1501 ctggcattga ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt
     1561 accctcacaa cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat
     1621 cctctctcgt ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc
     1681 atcagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac
     1741 attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga
     1801 atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga
     1861 cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga
     1921 tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc
     1981 agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca
     2041 gagcagattg tactgagagt gcaccattgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga
     2101 gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg
     2161 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat
     2221 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta
     2281 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa
     2341 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc
     2401 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt
     2461 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca
     2521 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg
     2581 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat
     2641 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta
     2701 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct
     2761 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac
     2821 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa
     2881 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa
     2941 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt
     3001 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca
     3061 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca
     3121 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc
     3181 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa
     3241 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc
     3301 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca
     3361 acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat
     3421 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag
     3481 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac
     3541 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt
     3601 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt
     3661 gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc
     3721 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat
     3781 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca
     3841 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga
     3901 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg
     3961 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg
     4021 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga
     4081 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa
//

质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
         1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
              ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
              ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
              ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
              ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
              ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
        2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
              四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
        3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
        4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
              单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
        6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。

二、转化图片

P2463/pENTR223-ITIH5(3点突变）人源基因质粒

P2464/pENTR223-DVL3人源基因质粒

P2465/pENTR223-IGHM人源基因质粒

P2466/pENTR223-TAP2-1395A人源基因质粒

P2467/pENTR223-OXR1-G3T人源基因质粒

P2468/pENTR223-CFB人源基因质粒

P2469/pENTR223-TTC14人源基因质粒

P2470/pENTR223-USHBP1人源基因质粒

P2471/pENTR223-TCEB3-C2311人源基因质粒

P2472/pENTR223-ATG7人源基因质粒

P2473/pENTR223-C1orf107-T2251G人源基因质粒