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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
NM_174936.3;FH3;PC9;NARC1;LDLCQ1;NAR
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pT7-His-pCSK9人源基因质粒
别称: NM_174936.3;FH3;PC9;NARC1;LDLCQ1;NAR
复制子:pBR322
原核抗性: Kan
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主：大肠杆菌
载体用途：蛋白表达
基因种属：人
基因类型：ORF
原核抗性：Kan
真核抗性：
荧光蛋白：
质粒简介
pT7-His-pCSK9是一个人源基因大肠表达质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 7366 bp ds-DNA circular SYN 24-八月-2017
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..7366
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 141..159
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 160..184
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
misc_feature 199..221
/note="RBS"
CDS 240..257
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
CDS 282..2360
/codon_start=1
/note="pCSK9"
/translation="MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLAL
RSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAAR
RGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITP
PRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASK
CDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVG
PLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATN
AQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMM
LSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCR
TVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGG
EGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKP
PVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGC
SALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ"
CDS 2367..2384
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
terminator 2451..2498
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
rep_origin 2535..2990
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
CDS complement(3083..3898)
/codon_start=1
/gene="aph(3')-Ia"
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/note="KanR"
/note="confers resistance to kanamycin"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
rep_origin 4020..4608
/direction=RIGHT
/note="ori"
/note="high-copy-number colE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(5038..5229)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
CDS complement(6038..7120)
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
promoter complement(7121..7198)
/gene="lacI"
/note="lacI promoter"
ORIGIN
1 tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt ccccatcggt gatgtcggcg atataggcgc
61 cagcaaccgc acctgtggcg ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg tagaggatcg
121 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa
181 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc
241 atcatcatca tcatcacagc agcggccgcg gatccgaatt catgggcacc gtcagctcca
301 ggcggtcctg gtggccgctg ccactgctgc tgctgctgct gctgctcctg ggtcccgcgg
361 gcgcccgtgc gcaggaggac gaggacggcg actacgagga gctggtgcta gccttgcgtt
421 ccgaggagga cggcctggcc gaagcacccg agcacggaac cacagccacc ttccaccgct
481 gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt ggtgctgaag gaggagaccc
541 acctctcgca gtcagagcgc actgcccgcc gcctgcaggc ccaggctgcc cgccggggat
601 acctcaccaa gatcctgcat gtcttccatg gccttcttcc tggcttcctg gtgaagatga
661 gtggcgacct gctggagctg gccttgaagt tgccccatgt cgactacatc gaggaggact
721 cctctgtctt tgcccagagc atcccgtgga acctggagcg gattacccct ccacggtacc
781 gggcggatga ataccagccc cccgacggag gcagcctggt ggaggtgtat ctcctagaca
841 ccagcataca gagtgaccac cgggaaatcg agggcagggt catggtcacc gacttcgaga
901 atgtgcccga ggaggacggg acccgcttcc acagacaggc cagcaagtgt gacagtcatg
961 gcacccacct ggcaggggtg gtcagcggcc gggatgccgg cgtggccaag ggtgccagca
1021 tgcgcagcct gcgcgtgctc aactgccaag ggaagggcac ggttagcggc accctcatag
1081 gcctggagtt tattcggaaa agccagctgg tccagcctgt ggggccactg gtggtgctgc
1141 tgcccctggc gggtgggtac agccgcgtcc tcaacgccgc ctgccagcgc ctggcgaggg
1201 ctggggtcgt gctggtcacc gctgccggca acttccggga cgatgcctgc ctctactccc
1261 cagcctcagc tcccgaggtc atcacagttg gggccaccaa tgcccaagac cagccggtga
1321 ccctggggac tttggggacc aactttggcc gctgtgtgga cctctttgcc ccaggggagg
1381 acatcattgg tgcctccagc gactgcagca cctgctttgt gtcacagagt gggacatcac
1441 aggctgctgc ccacgtggct ggcattgcag ccatgatgct gtctgccgag ccggagctca
1501 ccctggccga gttgaggcag agactgatcc acttctctgc caaagatgtc atcaatgagg
1561 cctggttccc tgaggaccag cgggtactga cccccaacct ggtggccgcc ctgcccccca
1621 gcacccatgg ggcaggttgg cagctgtttt gcaggactgt atggtcagca cactcggggc
1681 ctacacggat ggccacagcc gtcgcccgct gcgccccaga tgaggagctg ctgagctgct
1741 ccagtttctc caggagtggg aagcggcggg gcgagcgcat ggaggcccaa gggggcaagc
1801 tggtctgccg ggcccacaac gcttttgggg gtgagggtgt ctacgccatt gccaggtgct
1861 gcctgctacc ccaggccaac tgcagcgtcc acacagctcc accagctgag gccagcatgg
1921 ggacccgtgt ccactgccac caacagggcc acgtcctcac aggctgcagc tcccactggg
1981 aggtggagga ccttggcacc cacaagccgc ctgtgctgag gccacgaggt cagcccaacc
2041 agtgcgtggg ccacagggag gccagcatcc acgcttcctg ctgccatgcc ccaggtctgg
2101 aatgcaaagt caaggagcat ggaatcccgg cccctcagga gcaggtgacc gtggcctgcg
2161 aggagggctg gaccctgact ggctgcagtg ccctccctgg gacctcccac gtcctggggg
2221 cctacgccgt agacaacacg tgtgtagtca ggagccggga cgtcagcact acaggcagca
2281 ccagcgaagg ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac ctggcgcagg
2341 cctcccagga gctccagtga ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta
2401 acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac
2461 cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg
2521 gattggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac
2581 gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc
2641 ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt
2701 agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg
2761 ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac
2821 gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta
2881 ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat
2941 ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt caggtggcac
3001 ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat
3061 gtatccgctc atgaattaat tcttagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt
3121 tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag
3181 aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga
3241 ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg
3301 agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt
3361 tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca
3421 aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag
3481 gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa
3541 tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg
3601 cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag
3661 gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc
3721 tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga
3781 ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat
3841 ccatgttgga atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa
3901 caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgac caaaatccct
3961 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct
4021 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca
4081 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc
4141 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc
4201 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct
4261 gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag
4321 gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc
4381 tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg
4441 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag
4501 cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt
4561 gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac
4621 gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg
4681 ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc
4741 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg
4801 cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca
4861 gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga
4921 ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg
4981 tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca
5041 gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg
5101 gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc
5161 cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg
5221 tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat
5281 gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga
5341 acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca
5401 gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca
5461 tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact
5521 ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca
5581 gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca
5641 accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggggc
5701 cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac
5761 gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt
5821 cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc
5881 tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc
5941 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc
6001 ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg
6061 aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg
6121 tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct
6181 tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc
6241 gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt
6301 cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca
6361 ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat
6421 tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg
6481 ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg
6541 ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca
6601 gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg
6661 tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa
6721 tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa
6781 gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca
6841 cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt
6901 gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt
6961 gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg
7021 ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac
7081 cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac
7141 tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg
7201 ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg
7261 aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt
7321 cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgc
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pT7-His-pCSK9人源基因质粒
别称: NM_174936.3;FH3;PC9;NARC1;LDLCQ1;NAR
| 启动子: | T7 |
|---|
原核抗性: Kan
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主：大肠杆菌
载体用途：蛋白表达
基因种属：人
基因类型：ORF
原核抗性：Kan
真核抗性：
荧光蛋白：
质粒简介
pT7-His-pCSK9是一个人源基因大肠表达质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 7366 bp ds-DNA circular SYN 24-八月-2017
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..7366
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 141..159
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 160..184
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
misc_feature 199..221
/note="RBS"
CDS 240..257
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
CDS 282..2360
/codon_start=1
/note="pCSK9"
/translation="MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLAL
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PRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASK
CDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVG
PLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATN
AQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMM
LSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCR
TVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGG
EGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKP
PVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGC
SALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ"
CDS 2367..2384
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
terminator 2451..2498
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
rep_origin 2535..2990
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
CDS complement(3083..3898)
/codon_start=1
/gene="aph(3')-Ia"
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/note="KanR"
/note="confers resistance to kanamycin"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
TAFQVLEEYPDSGENIVDALAVFLRRLHSIPVCNCPFNSDRVFRLAQAQSRMNNGLVDA
SDFDDERNGWPVEQVWKEMHKLLPFSPDSVVTHGDFSLDNLIFDEGKLIGCIDVGRVGI
ADRYQDLAILWNCLGEFSPSLQKRLFQKYGIDNPDMNKLQFHLMLDEFF"
rep_origin 4020..4608
/direction=RIGHT
/note="ori"
/note="high-copy-number colE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(5038..5229)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
CDS complement(6038..7120)
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
promoter complement(7121..7198)
/gene="lacI"
/note="lacI promoter"
ORIGIN
1 tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt ccccatcggt gatgtcggcg atataggcgc
61 cagcaaccgc acctgtggcg ccggtgatgc cggccacgat gcgtccggcg tagaggatcg
121 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa
181 ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg ggcagcagcc
241 atcatcatca tcatcacagc agcggccgcg gatccgaatt catgggcacc gtcagctcca
301 ggcggtcctg gtggccgctg ccactgctgc tgctgctgct gctgctcctg ggtcccgcgg
361 gcgcccgtgc gcaggaggac gaggacggcg actacgagga gctggtgcta gccttgcgtt
421 ccgaggagga cggcctggcc gaagcacccg agcacggaac cacagccacc ttccaccgct
481 gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt ggtgctgaag gaggagaccc
541 acctctcgca gtcagagcgc actgcccgcc gcctgcaggc ccaggctgcc cgccggggat
601 acctcaccaa gatcctgcat gtcttccatg gccttcttcc tggcttcctg gtgaagatga
661 gtggcgacct gctggagctg gccttgaagt tgccccatgt cgactacatc gaggaggact
721 cctctgtctt tgcccagagc atcccgtgga acctggagcg gattacccct ccacggtacc
781 gggcggatga ataccagccc cccgacggag gcagcctggt ggaggtgtat ctcctagaca
841 ccagcataca gagtgaccac cgggaaatcg agggcagggt catggtcacc gacttcgaga
901 atgtgcccga ggaggacggg acccgcttcc acagacaggc cagcaagtgt gacagtcatg
961 gcacccacct ggcaggggtg gtcagcggcc gggatgccgg cgtggccaag ggtgccagca
1021 tgcgcagcct gcgcgtgctc aactgccaag ggaagggcac ggttagcggc accctcatag
1081 gcctggagtt tattcggaaa agccagctgg tccagcctgt ggggccactg gtggtgctgc
1141 tgcccctggc gggtgggtac agccgcgtcc tcaacgccgc ctgccagcgc ctggcgaggg
1201 ctggggtcgt gctggtcacc gctgccggca acttccggga cgatgcctgc ctctactccc
1261 cagcctcagc tcccgaggtc atcacagttg gggccaccaa tgcccaagac cagccggtga
1321 ccctggggac tttggggacc aactttggcc gctgtgtgga cctctttgcc ccaggggagg
1381 acatcattgg tgcctccagc gactgcagca cctgctttgt gtcacagagt gggacatcac
1441 aggctgctgc ccacgtggct ggcattgcag ccatgatgct gtctgccgag ccggagctca
1501 ccctggccga gttgaggcag agactgatcc acttctctgc caaagatgtc atcaatgagg
1561 cctggttccc tgaggaccag cgggtactga cccccaacct ggtggccgcc ctgcccccca
1621 gcacccatgg ggcaggttgg cagctgtttt gcaggactgt atggtcagca cactcggggc
1681 ctacacggat ggccacagcc gtcgcccgct gcgccccaga tgaggagctg ctgagctgct
1741 ccagtttctc caggagtggg aagcggcggg gcgagcgcat ggaggcccaa gggggcaagc
1801 tggtctgccg ggcccacaac gcttttgggg gtgagggtgt ctacgccatt gccaggtgct
1861 gcctgctacc ccaggccaac tgcagcgtcc acacagctcc accagctgag gccagcatgg
1921 ggacccgtgt ccactgccac caacagggcc acgtcctcac aggctgcagc tcccactggg
1981 aggtggagga ccttggcacc cacaagccgc ctgtgctgag gccacgaggt cagcccaacc
2041 agtgcgtggg ccacagggag gccagcatcc acgcttcctg ctgccatgcc ccaggtctgg
2101 aatgcaaagt caaggagcat ggaatcccgg cccctcagga gcaggtgacc gtggcctgcg
2161 aggagggctg gaccctgact ggctgcagtg ccctccctgg gacctcccac gtcctggggg
2221 cctacgccgt agacaacacg tgtgtagtca ggagccggga cgtcagcact acaggcagca
2281 ccagcgaagg ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac ctggcgcagg
2341 cctcccagga gctccagtga ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta
2401 acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac
2461 cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg
2521 gattggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac
2581 gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc
2641 ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt
2701 agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg
2761 ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac
2821 gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta
2881 ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat
2941 ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt caggtggcac
3001 ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat
3061 gtatccgctc atgaattaat tcttagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt
3121 tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag
3181 aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga
3241 ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg
3301 agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt
3361 tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca
3421 aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag
3481 gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa
3541 tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg
3601 cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag
3661 gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc
3721 tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga
3781 ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat
3841 ccatgttgga atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa
3901 caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgac caaaatccct
3961 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct
4021 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca
4081 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc
4141 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc
4201 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct
4261 gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag
4321 gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc
4381 tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg
4441 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag
4501 cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt
4561 gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac
4621 gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg
4681 ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc
4741 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg
4801 cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca
4861 gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga
4921 ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg
4981 tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca
5041 gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg
5101 gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc
5161 cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg
5221 tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat
5281 gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga
5341 acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca
5401 gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca
5461 tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact
5521 ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca
5581 gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca
5641 accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggggc
5701 cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac
5761 gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt
5821 cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc
5881 tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc
5941 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc
6001 ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg
6061 aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg
6121 tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct
6181 tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc
6241 gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt
6301 cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca
6361 ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat
6421 tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg
6481 ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg
6541 ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca
6601 gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg
6661 tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa
6721 tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa
6781 gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca
6841 cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt
6901 gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt
6961 gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg
7021 ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac
7081 cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac
7141 tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg
7201 ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg
7261 aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt
7321 cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgc
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质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
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文献和实验相关实验
shinesnowing 想构建一个能通过接合作用进入野生型弧菌并在其中表达外源基因的质粒，现在找到一个名为pBOR8的质粒，只有质粒简图，没找到全序列，质粒上的元件为ori R6K、mob RP4、Ap、lacIq，如下图: 现有两个问题想请教各位高人 （1）该质粒能否直接作为表达载体，将外源基因克隆到该质粒上，如果可以通常外源基因应该克隆到哪个位点？ （2）如果不能直接进行外源基因克隆和表达，那么应该
分，一是未稳定整合的，一是稳定整合的，所以开始时亮度要高。 2.为什么筛选后单克隆无荧光：首先，经过G418筛选，外源质粒不能整合入染色体的细胞死亡；其次，稳定整合的细胞外源质粒整合的位置存在位置效应，即整合于不利于外源基因表达的位置，从而使外源基因沉默；第三，我不知道你的质粒中是否加入了核糖体进入位点序列，如果有的话，研究显示该位点前后的基因表达水平存在不同，可以查查相关文献 3.有无好的办法：我认为没有，稳定转染筛选时有运气的成分，假如外源质粒恰好整合到了利于表达的染色体部位，这时筛
一、实验目的 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 二、实验原理 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入
pT7-His-pCSK9人源基因质粒
￥100 - 1000
