产品介绍
pPIC9k毕赤酵母表达质粒
基本信息
启动子: AOX1 promoter
复制子: pBR322 ori
质粒分类: 酵母系列,毕赤酵母表达载体
质粒大小: 9276bp
原核抗性: 氨苄青霉素Amp/卡那霉素Kan
筛选标记: HIS4/遗传霉素G418
克隆菌株: 大肠杆菌DH5α
培养条件: 37℃,有氧 LB
表达宿主: 酵母细胞
5'测序引物: 5′AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3'测序引物: 3′AOX:GGCAAATGGCATTCTGACAT
备注: 利用alpha分泌因子,分泌表达蛋白。
质粒简介
pPIC9K载体中存在卡那抗性基因,允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝。1.载体大小9276 bp。2.载体构建过程中,可供使用的单一限制性内切酶位点为 SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I. 3.利用alpha因子分泌信号肽,分泌表达蛋白基因。4.在载体构建过程中,你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。5.毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。6.为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型,KM71中产生His+ MutS基因型) 7..为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者Stu I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+ Mut+基因型,KM71中产生His+ MutS基因型) 8.将基因插入GS115的AOX1区域,需要使用Bgl II线性化质粒 (产生His+MutS基因型)。
质粒图谱
pPIC9k毕赤酵母表达质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
pPIC9k毕赤酵母表达质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。