产品介绍
pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Control质粒
基本信息
启动子: CMV promoter
复制子: pUC Ori,F1 Ori,SV40 Ori
终止子: HSV TK poly(A) signal
质粒分类: 哺乳细胞质粒;哺乳编辑质粒;干扰RNA质粒
质粒大小: 5759bp
原核抗性: 壮观霉素Spe
筛选标记: 杀稻瘟菌素Blast
克隆菌株: DH5α等大肠杆菌
培养条件: 37℃,有氧,LB
表达宿主: 293T等哺乳细胞
培养条件: 37℃,有氧,5%CO2
诱导方式: 无需诱导
5'测序引物: pEGFP-C-5
3'测序引物: HSVtk-pA-R:GTCTCCTTCCGTGTTTCAG
备注: 可连入miRNA片段
质粒简介
pCDNA6.2-GW-EmGFP-miR-Control质粒是在pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性化载体的基础上连入了一个小片段而成。如果需要连入其它miRNA片段,可通过引物退火加酶切连接的方式连入。 转染后可立即表达 miRNA。 所表达的 miRNA 在核内经内源细胞机制(包括 Drosha 酶)加工后,转运至细胞质,由 Dicer 酶进一步加工)。 然后,完成加工的 miRNA 结合到 RISC,在此处其功能类似于 siRNA,使 mRNA 靶标被切割。
带有 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒将传统 RNAi 载体的优点(表达稳定并能够使用病毒导入)以及组织特异性表达和同一转录本多靶点抑制的功能集于一身。 带有 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒含有的 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 载体设计用于表达人工 miRNA,该 miRNA 经工程化改造,与目的基因序列有 100% 的同源性并能引起靶标分子的切割。 该载体包括内源性 miRNA 的侧翼序列和环序列,内源性 miRNA 可指导从较长的 Pol II 转录本 (pre-miRNA) 上切除工程化的 miRNA。 使用的BLOCK-iT RNAi Designer,超过 70% 的重组体能产生超过 70% 的抑制效率。 工程化 miRNA 的 Pol II 表达可实现:
在 CMV 即刻早期启动子作用下高效表达,可通过 MultiSite Gateway重组选择组织特异性启动子和其它受调控的启动子;
在 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体中同-顺反子表达 Emerald GFP (EmGFP) 报告基因,使 EmGFP 的表达与目的 miRNA 抑制活性之间具有极强的相关性;
与用于基因表达的多种 Invitrogen Gateway® 目的 (DEST) 载体兼容;包括用于稳定转导分裂细胞、非分裂细胞和原代细胞类型的慢病毒载体,用于染色体单位点整合的 Flp-In™ 系统,以及替代报告基因融合构建体;
可在同一转录本表达的工程化 miRNA 多于一种,从而可同时抑制多个基因并产生合成表型;
质粒图谱
pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Control质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Control质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。