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连桥生物
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D-Hanks缓冲液(含酚红)又叫D-Hanks缓冲液(HBSS),含酚红,不含钙镁,pH7.2-7.4,15-30℃保存。D-Hanks缓冲液(含酚红)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有培养基有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。
D-Hanks缓冲液(含酚红)使用步骤:
(一)准确称量试剂:根据不同的菌类和用途,选择适宜的培养基,培养基所需试剂必须纯净。
(二)校正pH值:将称量好的培养基各种成分放入容器内,标记划线,加热溶解,补充水分,测定酸碱度,常用pH6.8~8.0的精密试纸或酸度计测定。用1NNaOH和1NHCl调节pH值到适宜范围内。
(三)过滤:将玻璃漏斗置铁架上,再用D-Hanks缓冲液纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中,将上述培养基倒入其中过滤至透明。
(四)分装:将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5mL;三角瓶中装100~150ml),塞好棉塞用牛皮纸包扎好,准备灭菌。
(五)灭菌:培养基的灭菌,常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死,但细菌的芽胞有较强的抗热性,须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。
根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理,即压力越大,蒸汽温度就越高。因此,在同一温度条件下,采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下,菌体吸收水分后,其蛋白质易于凝固变性,因为蒸汽的穿透力强,杀菌效果好。
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文献和实验网友eming43的经验 支原体的检测. PCR法 原理 该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增,来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16sr RNA基因上的支原体特异片段,此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳,经溴乙啶(EB)染色后在紫外透射仪上进行检测。 u 16sr DNA引物用水稀释至40umol/L。 (1).正向引物:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’ (2).反向
后,用1:1的甘油-PBS封片,在荧光显微镜下进行观察,照相记录。 (4)DNA Ladder的检测 在细胞凋亡过程中由于限制性内切酶被激活,细胞核DNA在核小体间发生特异性降解,形成180~200bp或其整数倍的片段,经过琼脂糖凝胶电泳后呈现出梯状条带,即DNA ladder这一现象被视为细胞凋亡发生与否的典型特征。 ①收集经处理、培养的细胞,用预冷的D-Hanks液洗涤3遍。 ②以500g离心10min,弃掉上清液。 ③在沉淀中加入预冷的裂解缓冲液。使细胞充分悬浮,然后在冰上裂解90
单细胞琼脂糖凝胶电泳Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)
一、 细胞悬液的制备 : 1. 吸弃旧培养基,D-Hanks冲洗2遍 2. 0.25%胰酶消化,待细胞变圆,间隙增大,立即终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞,使成细胞悬液,加入 离心管 ,1000rpm,离心10min,弃上清,以1mlD-Hanks悬浮细胞,以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×10 6 个,必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中,此步在暗室及较低温度下进行
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