- ￥1200
- 晶风生物
- 中国
- TF8507
- 2025年11月04日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
三个月
- 英文名：
EGFR L858R质粒载体
- 库存：
10
- 供应商：
晶风生物
- 规格：
约0.5ug
产品名称：EGFR L858R质粒载体
产品规格：0.5ug质粒干粉（实际规格可能会有出路，具体规格价格请和客服核实）
亲爱的科研工作者，感谢您信任晶风生物，我们致力于为大家分享质优价适的质粒，受各种因素影响，我们只保证质粒的关键序列测序正确，不能保证实验效果。请您收到质粒后请务必先转化，再挑取单菌落扩增，不要直接使用。如果您需要即用的大包装质粒或病毒颗粒，可委托我们制备，性价比更高。
EGFR L858R质粒载体扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h，（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
转化图片：
EGFR L858R质粒载体提取步骤：（本步骤仅做示例，非该产品实际提取步骤）
实验原理：
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、操作步骤：
1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8µl 相应抗生素，可适量多加；
2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）；
3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，室温10000rpm离心2min，去上清；（可重复步骤2，直至菌液离心完）（去上清时用纸吸一下）
4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体菌体；
5. 向离心管中加入250µl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度）
6. 向离心管中加入350µl Buffer N3， 立即温和地上下颠倒混匀4~6次，此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min；
7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min，至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液；
8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）；
10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风4min左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）；
11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70μl即可），室温静置2min。10000rpm离心1min；
12. 把液体倒回吸附柱，在10000rpm离心1min；
13. 混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。
三、注意事项：
1.使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
2.Buffer EB在65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。
更多质粒载体，请咨询我公司：EGFR L858R质粒载体
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文献和实验厦门大学的研究团队评估了 EGFR 作为三阴乳腺癌免疫治疗靶点的可能性，通过体内实验和体外实验的结果得出，EGFR CAR-T 细胞展示出对三阴乳腺癌细胞强大的杀伤效果和潜力，提出 EGFR CAR-T 可以进一步向临床方向进行探索，获益更多的患者。 三阴乳腺癌（TNBC）以其侵袭性强、复发快速和预后效果差而闻名。目前以嵌合抗原受体 T (CAR-T)细胞为首的免疫疗法，已经成为治疗 TNBC 的一种有效工具，而其中肿瘤特异性抗原的选择和 CAR 结构的设计成为 CAR-T 治疗的挑战。 中国
。在中国 NSCLC 患者中，EGFR 突变率约为 30％，其中腺癌患者的突变率高达 50％ 左右。研究发现，EGFR-T790M 突变小鼠以及 EGFR-L858R-T790M 突变小鼠比 EGFR-L858R 单突变小鼠的肿瘤潜伏期要更长，更适适用于耐药性机制研究[4]。 图 3. EGFR 相关信号通路 集萃药康针对 EGFR 突变靶点也做了相应的布局，包括 20 号外显子 T790M 点突变，C797S 突变及 21 号外显子 L858R 突变小鼠模型，与组织特异性 cre 鼠配繁
Clinical Advancement of EGFR Inhibitors in Cancer Therapy
The epidermal growth factor receptor (EGFR) represents one of the most promising molecular targets in cancer therapeutics. An array of EGFR inhibitory drugs have been developed that are progressing rapidly in oncology clinical trials
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