blizarrd
发表于 2012-06-13 11:26
先讲讲内参的作用:
内参主要用来校正起始模板量差异以及后续处理中带来的人为差异,相当于数据处理中常用的归一化。
我举个例子说吧:
有A、B两个样本,A样本是从10万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板,B样本是从20万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板,我们要看这两样本中某一基因的表达差异,选GAPDH基因为内参。不考虑其他因素影响的情况下,如果A样本的内参Ct值为20的话,B样本的Ct值就是19(2倍差异),同样,假设A、B样本中目的基因表达量一致的话,A样本目的基因Ct值为25,那B样本的Ct值就为24,然后计算各自ΔCt为-5,ΔΔCt为0,得出A、B样本表达量一致。
如果内参Ct值差异大,要具体问题具体分析,先看三个重复的Ct值差异(尽量控制在0.5以内),复孔没问题时,如果采用染料法,再检查熔解曲线是否正常,如果这些都没有问题就不需要重做了。
Ct值的大小由定义的阈值决定,阈值可以在扩增曲线的指数增长期任意人为设定,所有Ct值的大小本身没什么意义,ΔCt(样本目的基因和该样本内参Ct值的差值)才是恒定的。