whr75
发表于 2004-06-29 17:39
RACE PCR 资料:
1. 传统的cDNA克隆化技术的缺点:理想的克隆cDNA应包含模板mRNA的5'帽的结构以及3'多聚A尾的全长序列。 然而,传统的方法克隆的cDNA,多数情况下其5'末端为部分缺失状态。究其原因有二:一是在以mRNA模板进行逆转录过程中,逆转录酶在从模板mRNA中逆转录酶脱落,只能得到部分拷贝的cDNA产物;二是在进行逆转录过程中,用了部分5'末端被降解的mRNA为模板合成cDNA,因此在构建cDNA文库中得到的多数是5'末端部分缺失状态的cDNA。换言之,在构建cDNA文库的过程中,应用逆转录酶以及应用极易受降解的mRNA是不可避免的,因此5'末端部分缺失就不足为奇了。
2.全長cDNA的克隆:为了构建含全長的cDNA 文库,就有必要从含有多数为非全长的cDNA文库中挑选出全長cDNA的一个过程。如果我们有办法识别全長cDNA的5'端和3'端,就有可能挑选出全长cDNA。 mRNA的3'端中有一个多聚 A尾结构可作为明确的识别标记。事实上、传统的cDNA文库的构建过程,也正是利用了 mRNA 3'端这一特征性的标签(tag),用多聚T引物合成cDNA的第一链而构建的。在mRNA的5'端存在一个帽结构,而自然状态下的这一结构不能象3'端的多聚 A尾一样,直接作为一个识别标记。由此可以设想,把这一结构用某种序列来替换,使其变成一个象多聚 A尾一样的特征性的序列标签(sequence tag),就有可能作为一个识别标记,这就是寡核苷酸帽法作为 5'端的识别标记的思路。
3. 全長cDNA文库的构建:为了克服传统的方法构建cDNA文库中所存在的缺点,铃木等开发了用特征性的序列标签替换mRNA5'端的帽的新方法—寡核苷酸帽法(Oligo caping method)。这一方法所获得的mRNA 5'端有RNA寡核苷,3'端有多聚 A尾特征性,因此其两端均有特征性的序列标签作为识别标记,我们就可能构建只含有全长cDNA的文库。
4.本技术的意义:确定启动子区域精确的确定基因的转录起始位点。基因的启动子区域中含有许多重要的调控基因转录的DNA序列(顺式元件),若要阐明基因在转录水平上的调控机制,克隆启动子序列是必不可缺的关键一环。到目前为止,已阐明启动子序列以及它们的调控机制的基因数量非常有限。事实上,标准的真核生物有关的启动子数据库Eukaryotic Promoter Database中登录的基因启动子也不过数百个而已。这其中一个重要原因之一是许多基因未能确切的确定转录起始位点。S1核酸酶作图法、引物延伸法、5'RACE法等传统的转录位点的确定方法,技術要求比较高,且有时由于种种原因,难以确定确切的转录起始位点。而利用铃木等开发的寡核苷酸帽法构建的cDNA文库中,随机的克隆全長的cDNA,适合于大规模、精确的获得基因转录起始位点的信息。