1. 挑取培养皿上单一菌落,培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中,以120 rpm 转速震荡,在37℃下培养过夜。
2. 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中,以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后,加入IPTG成为1 mM浓度,继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。
3. 将菌液倒入50 mL 离心管 (conical tube) 中离心10 min (5 000 rpm)。
4. 倒去上清,可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。
5. 取出含菌块的离心管置碎冰上,待菌块溶解后,以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。
6. 将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次,尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。
7. 离心20 min (12 000 rpm,4℃) 取上清共 _____ mL,称为 粗抽取液 (XT);预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上,以低温进行实验。
8. 此上清加入5 mL buffer A-0 混匀后倒入烧杯,置碎冰上放冷,不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度,加完后再搅拌10 min。
9. 离心20 min (12 000 rpm,4℃) 后小心倒去上清,取白色沉淀部份。
10. 沉淀加以2 mL buffer A-150 均匀悬浊的,再以桌上型离心机去除不溶物质,(10 000 rpm,5 min),共得 ______ mL,称为 全蛋白质 (TP);预留100 uL,连同上述XT 置4℃冷藏。
11. 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析,标示清楚后置4℃冷藏。
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