标签: DNA 结合蛋白
本实验主要用于检测粗制提取物中序列特异性的DNA结合蛋白。
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1. 目的DNA的长度应小于300bp,以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定,则应用短的寡核苷酸片段(约为25bp),这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。
2. 凝胶迁移实验需要的结合蛋白,可来源于纯化或部分纯化的蛋白,或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般,DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记,同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。结合反应所需的组分有:含盐的溶液(氯化镁,氯化钠,或氯化钾)、缓冲体系(Tris-HCl或HEPES)、还原剂(DTT)、甘油、非特异的竞争DNA(poly(dI:dC)(dI:dC)),也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物,随后将凝胶干燥并放射自显影, 或用PhosphorImage分析。
3. 凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速,但要成功地进行凝胶迁移实验,需要优化一些参数,这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素:抽提液的制备(核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解),结合蛋白的浓度,探针的浓度,非特异性探针的浓度,缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件,保温时间和温度,载体蛋白, 是否有辅助因子(比如锌,或镉等金属离子,或激素)。总之,反应总体积应最小(20uL)。
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