关键词: 层析方法 选择
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纯化包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或尿素中。高化学稳定性的Sepharose12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白质需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品,并可以使1M NaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白,复性回收效率明显提高。
包涵体蛋白固相复性
将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上,一般用Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后,蛋白在介质上成功复性,再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白聚体的形成,所以复性锝率更高,而且无需大量稀释样品,并将复性和初纯化合二为一,大大节省时间及提高回收率。
固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组胺酸融合蛋白;以及以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用。
纯化中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。传统中药多是前熬后服用,有效成分多为亲水,包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合地利用多种层析方法,如离子交换、分子筛、反相层析,更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛选功能,例如,用甲醇分离黄酮甙,三糖甙先被洗下来,二糖甙其次,单糖甙随后,最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂,广泛用于各种天然产物的分离,包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内酯、萜类、甾类等。
生物碱在酸性缓冲液中带正电,成为盐,HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常相似的生物碱。相反,黄酮、醌类、皂甙、有机酸等可溶预溶于偏碱的缓冲液中,在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。一般多糖纯化大多使用分子筛,如Sephadex,Sephacry1。若分子量在60万以下,并需更高等分辨率,可选择新一代的Superdex。一种植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组分纯品。另外,多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质,传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。 SURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂,SURCE反相层析可用范围为PH1-14,并可用1M NaOH、1M HCI清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗,寿命也更长。
纯化肽类
肽类的来源有天然萃取、合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解,但可以从有机溶剂或促溶剂中复性,所以以高选择性的反相层析如Sephasil、PepRPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱,能配合反相层析作出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。
纯化核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子,和质粒DNA一样,可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白,再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。
纯化寡核苷酸
寡核苷酸多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等的研究。合成后含三苯甲基的寡聚核苷酸译音离子、以阴离子交换的MonoQ或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可去除副产物,并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析,可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
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