关键词: 显色 HRP酶 底物
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显色(HRP酶)
1.增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理:氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物,是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺(luminol,5'-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)的分子结构及化学反应式如下:
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物,也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中,含有H2O2和鲁米诺,在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下,发出荧光来。
试验步骤:
1)将两种显色底物1:1等体积混合(一般各1ml/membrane)。
2)将混合物覆盖在膜表面,1-2分钟,摇晃使均匀。
3)用保鲜膜把膜包起来,放入夹板中。
4)在暗室中将X光片,覆盖在膜的上面,夹好夹子,曝光1min。
5)显影、定影。
6)根据结果调整曝光时间和曝光区域,得到最佳结果。
注意:荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB显色
DAB(3,3二氨基联苯胺)和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂,对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色,它们在碱性磷酸酶(AP)作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
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