关键词: 免疫荧光 直接法 间接法 异同
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免疫荧光细胞化学方法的原理是根据抗原抗体反应的规律,把已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗原或抗体,然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。方法具体种类有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下,根据其形成复合物所发的荧光,来确定判断检测物的来源、性质和部位。
1、直接法:这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体,染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育,使之直接与载玻片上的抗原结合,在荧光显微镜下直接观察,作出判断。该方法评价:简单易行、特异性高、快速方便,常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质,敏感性较差,效果有时不理想,目前较少作为更多方面的检测。
2、间接法:该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价:由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。目前本法应用较广泛,只需制备一种种属荧光抗体,即可适用于多种第一抗体的标记显示。
3、如果你有针对待查抗原一抗(荧光素标记),而且你的待检抗原表达也比较丰富的话,做直接法也未尝不可。不过如果你不具备上述两个条件的话,还是推荐你做间接法。
4、如果你做的是细胞骨架,那么就是用直接免疫荧光。如果是一般的蛋白表达,这个要看有没有试剂是直接标记的;如果没有,还是只能考虑间接荧光。直接荧光相对间接荧光可以避免非特异姓染色,当然步骤也少了些。我做过细胞骨架的直接染色,效果很好。
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