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10kDa 干扰素γ诱导蛋白(IP10)在牛生物样本中的精确检测实验

关键词: ELISA 试剂盒 细胞裂解液 2018-02-27 10:32 来源:东林 点击次数:201

预期应用

本试剂盒运用双抗体夹心 ELISA 法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中 IP10 含量。

需自备的设备及试剂

1.450±10nm 滤光片的酶标仪 (建议仪器使用前提前预热)2.单道或多道微量加液器及吸头

3.稀释样品的 EP 管

4.蒸馏水或去离子水

5.吸水纸

6.盛放洗液的容器

标本的采集与保存

1. 血清:

将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4oC 过夜,然后 1000×g 离心 20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20oC 或-80oC 保存,但应避免反复冻融。

2. 血浆:

用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8oC 1000×g 离心 15 分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20oC 或-80oC 保存,但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆:

1)取适量组织块,于预冷 PBS(0.01mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液,称重后备用(组织块较大需先剪碎后再匀浆);2)可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果:首先将组织块移入玻璃匀浆器,加入 5-10 mL 预冷 PBS 进行充分研磨,该过程需在冰上进行(有条件实验室可选用机器匀浆);得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融 进一步处理(超声破碎过程中注意冰浴降温;反复冻融法可重复 2 次)。

3)将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟,留取上清即可检测。

4. 细胞裂解液:

1)贴壁细胞需要先用胰酶消化,离心收集细胞(悬浮细胞可直接离心收集);2)将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次;

3)物理方法裂解细胞(可先超声破碎细胞,再反复冻融):

i 超声破碎:取适量 PBS 重悬细胞,用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂。

ii 反复冻融:将待破碎的细胞在-20oC 以下冰冻,室温融解,反复 3 次,使细胞溶胀破碎。

4)将标本于 2-8oC 1500×g 离心 10 分钟,收集上清备用。

5. 细胞培养上清或其它生物标本:

请 1000×g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20oC 或-80oC 保存,但应避免反复冻融。

注意:

1. 以上标本均需密封保存,4oC 保存应小于 1 周,-20oC 不应超过 1 个月,-80oC 不应超过 2 个月。

2. 标本使用前应缓慢均衡至室温,不应加热使之融解。

3. 标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

试剂准备

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温 (18-25oC),试剂不能直接在 37oC 溶解。

2.标准品 (冻干品):每瓶标准品加入标准品稀释液 1 mL,盖好后室温静置大约 10 分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为 10ng/mL。准备 7 个稀释标准品的 EP 管,每个 EP 管中加入 500μL 的标准品稀释液,如图所示依次倍比稀释成 10ng/mL,5ng/mL,2.5ng/mL,1.25ng/mL,0.625ng/mL,0.312ng/mL,0.156ng/mL,标准品稀释液 (0ng/mL) 直接作为空白孔。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

3.检测溶液 A 及检测溶液 B:Detection A 及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液 A 或 B1:100 稀释 (如:10μL 检测溶液 A/990μL 检测稀释液 A),充分混匀,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制 (100μL/孔),实际配制时应多配制 0.1-0.2 mL。

4.浓洗涤液:用 580 mL 蒸馏水或去离子水将 20 mL 浓洗涤液稀释至 600 mL,进行 30 倍稀释。

5.底物溶液:请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的 TMB 至另一干净容器中使用,容器中剩余的底物应予丢弃,不要倒回 TMB 瓶中。

注意:

1、 标准品的稀释不能直接在板中进行。

2、 标准品请于临用前 15 分钟内配制。该标准品只能使用一次。

3、 标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请使用相应的稀释液配制,不能混淆。混匀时要轻轻充分混匀,避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管,并校准微量加液器。请依据所需的量精确配制,尽量不要微量配制 (如吸取检测溶液 A 时,一次不要小于 10μL),以避免造成浓度误差。

4、 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液和检测溶液 B 工作液。

5、 浓洗涤液中如有结晶析出,请先温育至室温,轻轻混匀,至到结晶完全溶解再进行配制。

6、 试剂盒中部分试剂为储存液,客户需配置成工作液后使用,在配置过程中如因纯净水质量差或水质污染,以及实验中所用耗材洁净度差,可能造成实验结果不准确,甚至完全错误,请使用双蒸水。

操作步骤

1.加样:分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔 7 孔,依次加入 100μL 不同浓度的标准品 (见试剂准备 2)。空白孔加 100μL(见试剂准备第二步最后一管),余孔加待测样品 100μL,酶标板加上覆膜,37oC 温育 2 小时。

2.弃去液体,甩干,不用洗涤。

3.每孔加检测溶液 A 工作液 100μL(临用前配制),酶标板加上覆膜,37oC 温育 1 小时。

4.弃去孔内液体,每孔用 300μL 的洗涤液洗涤,浸泡 1-2 分钟,吸去 (不可触及板壁) 或甩掉酶标板内的液体,在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次 (也可轻拍将孔内液体拍干),重复洗板 3 次。最后一次洗涤后,要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。

5.每孔加检测溶液 B 工作液 (临用前配制)100μL,加上覆膜,37oC 温育 1 小时。

6.弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,方法同步骤 4。

7.每孔加底物溶液 90μL,酶标板加上覆膜,37oC 避光显色 (反应时间控制在 15-25 分钟,不要超过 30 分钟。当标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色,后 3-4 孔梯度不明显时,即可终止)。

8.每孔加终止溶液 50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一,请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后,立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度 (O.D. 值)。

注意:

1.试剂准备:准备一次实验所需要的酶标条,其它的可从微孔板上拆下,密封,按照说明书要求保存,以备下次使用。

2.加样:实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。加样时注意不要有气泡,将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。加样或加试剂时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的「预温育」时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此,一次加样时间 (包括标准品及所有样品) 最好控制在 10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。

3.温育:为防止样品蒸发,实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内,以避免液体蒸发,洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态,同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4.洗涤:充分的洗涤非常重要,在每次洗涤过程中,都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。

5.反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化 (比如,每隔 10 分钟观察一次),如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

6.底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。

7.如果实验室内湿度低于 60%,推荐使用加湿器提高湿度水平。

典型数据

为了便于计算,尽管浓度为自变量而 O.D. 值为因变量,我们绘图时仍采用标准品的 O.D. 值作为横坐标 (X 轴),标准品的浓度为纵坐标 (Y 轴)。同时为了试验结果的直观性,图中提供的是原始数据而非对数值。推荐使用对数 值建立标准曲线图。由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和温度条件等),标准曲线的 O.D. 值会有所差异。所提供的标准曲线仅供参考,实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。

牛 10kDa 干扰素γ诱导蛋白 (IP10) 检测试剂盒标准曲线检测范围

0.156-10ng/mL

最低检测限

0.058ng/mL

此值为 20 个空白样品 (即标准品稀释液) 测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。

精密度

精密度用样品测定值的变异系数 CV 表示。CV(%) = SD/mean×100批内差:取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测, 每份样本连续测定 20 次,分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批间差:选取 3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定,每个样本使用同一试剂盒重复测定 8 次,分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批内差: CV<10%

批间差: CV<12%

You can reference link of the kit as following

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-ip10-b.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-ip10-c.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-ip10-hu.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-ip10-mu.html

http://www.dldevelop.com/Research-reagent/dl-ip10-ra.html

编辑: 齐梦霞2
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