3.杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液,杂交时偶尔摇动杂交袋,使里面的溶液重新分配。
杂交液组成: 50%甲酰胺(V/V)
5%(W/V)封阻试剂
5㗓SC
0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠
0.02%(W/V)SDS
新变性标记DNA(150ng/ml)
杂交液取代预杂交液,替换间膜不能干,成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16~20h)。
4.洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液计算。
(1)在室温下用2㗓SC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。
(2)在65℃条件下用0.1㗓SC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。
(3)在室温下用2㗓SC溶液漂洗1次。
5.免疫测定
(1)配制溶液
缓冲液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
缓冲液2:0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50~70℃,此溶液保持混浊)。
缓冲液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
缓冲液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
显色溶液:新鲜配制,在10ml缓冲液3中,加45NBT溶液(管9)和35X-磷酸盐缓冲液(管10)。
2. 显色过程
A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。
B.在100ml缓冲2中保温30min。
C.再用缓冲液1短暂洗涤。