关键词: 细胞凋亡 检测 生化特征
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2)琼脂糖凝胶电泳的定量检测
简易末端标记法
1.按常规提取细胞DNA。 2.在0.5ml的EP管中加入细胞DNA,反应体系如下:细胞DNA 0.5~1.0μg,10×缓冲液2μl,32P-dATP(或-dCTP)0.5μCi,Klenow聚合酶5U,双蒸水加至20μl。 3.混匀后稍加离心,室温反应30min。 4.加1μl 0.5mol EDTA终止反应。 5.常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次,无水乙醇沉淀DNA,真空抽干。 6.溶于20μl的TE缓冲液中。 7.取标记DNA在1.8%琼脂糖凝胶上点样,50V电泳约2h。 8.电泳后的凝集置滤纸上烘干,进行放射自显影。 5’末端32P标记法
细胞DNA的提取
1.细胞悬液离心后,沉淀加消化缓冲液0.5ml,50℃ 3~5h,或37℃过夜。 2.用等体积的酚:氯仿:异戊醇抽提细胞裂解液。 3.将水相转移至新的试管,加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。 4.加入2倍体积的预冷无水乙醇,置液氮5min或-20℃ 12h。 5.12 000r/min离心沉淀DNA,70%乙醇洗1次后,真空抽干。 6.溶于20μl的TE缓冲液中。 7.加入终浓度为10μg/ml RNase,37℃,30min。 8.同法用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。 9.溶液20μl的TE缓冲液中,-20℃保存备用。DNA含量测定:用260nm波长紫外分光光度计:吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。
DNA 5’末端脱磷酸
1.取纯化的细胞DNA 10μg,然后加入:10×CIP 2μl(1U),双蒸水加至50μl。 2.37℃水浴2h。 3.90℃水浴5min以灭活CIP。 4.用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,乙醇沉淀,真空抽干。
DNA 5’末端32P标记
1.将脱磷酸样品DNA置冰浴上,再加双蒸水10μl,10×缓冲液2μl,T4多核苷酸激酶10U,32P-ATP 740kBq(20μCi),双蒸水加至20μl。 2.混合后,37℃水浴60min。 3.加入1μl的0.5mol/L EDTA,90℃灭活5min。
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