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血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)

关键词: 电泳,血红蛋白 2012-04-13 00:00 来源:互联网 点击次数:2695

实验原理

血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)目的是检出和确认各种正常和异常的血红蛋白。

根据不同的血红蛋白带有不同的电荷,等电点不同,在一定的pH缓冲液中,血红蛋白的等电点小于缓冲液的pH时带负电荷,电泳时在电场中向阳极泳动,反之,Hb带正电荷向阴极泳动。

在一定电压下,经过一定时间的电泳,不同的血红蛋白所带电荷不同,分子量不同,其泳动方向和速度不同,可分离出各自的区带,同时对电泳出的各区带进行比色或电泳扫描,可进行各种血红蛋白的定量分析。一般最常用的是pH8.6醋酸纤维薄膜电泳。

胞浆内存在糖原或多糖类物质(如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸(periodic acid)氧化,转变为二醛基(CHO-CHO),与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合,形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应,以前也称为糖原染色。

实验方法

材料:

1. 缓冲液

(1)pH8.6 TEB缓冲液:称取Tris10.29 g,EDTA 0.6 g,硼酸3.2 g,加蒸馏水至1000 ml。

(2)硼酸盐缓冲液:称取硼砂6.87 g,硼酸5.56 g,加蒸馏水至1000 ml。

2. 醋酸纤维薄膜、电泳仪、加样器、分光光度计、比色杯。

方法:

1. 血红蛋白溶液的制备

取肝素或者枸橼酸钠抗凝血3 ml,2000 rpm离心10分钟后弃去血浆;用生理盐水洗涤红细胞三次(750 rpm,离心5分钟),再2200 rpm,离心10分钟,弃去上清液;加入等量的蒸馏水;再加入0.5倍体积四氯化碳,用力振摇5分钟,2200 rpm,离心10分钟后将上层Hb液吸出备用。

2. 浸膜

将醋酸纤维薄膜剪成3 cm×8 cm的纸条,浸入pH8.6 TEB缓冲液,浸透后取出,用滤纸吸干。

3. 点样

用加样器取血红蛋白液10 μl,然后垂直点样到醋酸纤维膜上(毛面),距边缘1.5 cm处。

4. 电泳

将硼酸盐缓冲液作为电泳缓冲液倒入电泳槽中,将点样后的醋酸纤维膜放于电泳槽架上,点样在阴极端,200 V,30分钟。

5. 洗脱

分别剪下HbA、HbA2,放入试管内,分别加入蒸馏水15 ml和3 ml,轻轻振荡,待血红蛋白完全洗脱后,混匀。

6. 比色

洗脱液用蒸馏水空白调零,415 nm测定吸光度。

7. 计算

HbA2(%)=HbA2管吸光度/(HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度)×100%

实验结果计算

pH8.6 TEB缓冲液醋酸纤维电泳参考范围:HbA>95%,HbA2 1%-3.1%

注意事项

1. 电泳时间不能太长,电泳时醋纤膜不能变干,故应观察到HbA和HbA2清晰分开就停止电泳,电泳时间太长区带反而扩散模糊;

2. 点样量不能太多,如血红蛋白液太多,色带易脱落或染色不透,可出现HbA相对增高的假阳性结果;

3. 避免醋酸纤维膜被蛋白质污染;

4.电流不应过大,否则血红蛋白分不开带;

5.应同时做正常人和必要的已知异常血红蛋白的标本对照。

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