关键词: shRNA序列
来源: 丁香园论坛
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短发夹RNA (small hairpin RNA,shRNA)可在细胞中被加工成siRNA。设计shRNA时,shRNA中两个反向重复序列的设计原则与siRNA序列的设计相同,需要重点考虑的是shRNA 环序列的长度及组成,而且环序列不能与靶基因内的其它序列具有同源性。1 .shRNA环序列的长度一般来讲,设计shRNA时选择3~10 nt长度的发夹环均可。Brummelkamp等[18]构建了具有5 nt、7 nt、9 nt环的shRNA,比较它们在MCF?7细胞中抑制CHD1基因的效果:9 nt环的shRNA抑制率达90%;7 nt环的shRNA只有中等的抑制率;5 nt环的shRNA则无抑制活性。但是Siolas等[8] 报道,环序列的长度对RNAi效率无明显影响。2.hRNA环序列的组成
研究表明,当shRNA发夹环的组成为 “UUGAUAUCCG”和“UUCAAGAGA”时具有较高的抑制效率。当发夹环前面的序列是以“UU”终止时,应该选用“CCACACC”环序列[12]。环序列中有2个U对产生有效的基因抑制很重要[18];但环序列中不能有连续3个以上的U[12] ,因为这可能导致shRNA转录的提前终止。
3 .siRNA阴性对照序列的设计所有的RNAi 试验均应设立阴性对照,siRNA 阴性对照序列的合理设计与siRNA 序列的设计同样重要。因为有效的对照可以充分证明siRNA 只对靶基因产生特异性基因沉默,从而增强实验的可信度。阴性对照siRNA包括碱基错配或混乱序列的siRNA。在实验中最好设计两条siRNA 对照序列。3.1碱基错配的阴性对照siRNA最初的研究证明,在siRNA双链内,一个碱基的突变就足以阻断RNAi 过程。反义链内具有1~2 个碱基错配的阴性对照siRNA可用于鉴别RNAi 通路和micro RNA 通路,因为后者是由碱基的非精确配对引起。最近的研究表明:siRNA 允许其分子中心部位存在单个碱基突变,siRNA完全失活需要大于3个碱基的突变[19],在Mangeot [20]的研究中,对照siRNA序列中含有6个精确定位的突变碱基,也证明了这点。
Kim 等[7]的研究表明,在27 nt的siRNA中,有3个碱基错配的对照siRNA序列可以在不同的浓度下阻断针对靶基因的RNAi过程,而单个碱基错配的siRNA仅在相对高的浓度下才可阻断RNAi过程,所以多碱基错配比单碱基错配的siRNA阴性对照序列具有更高的实际应用价值。
此外,对于RNAi效应而言,位于siRNA序列中部的碱基错配比位于siRNA序列尾部的碱基错配更有效。3.2 混乱序列的阴性对照siRNA来源于siRNA序列的混乱序列siRNA,在siRNA实验中是一个阴性对照,作为一个信息控制可反映RNAi的特异性。混乱序列siRNA与siRNA序列相比具有相同的核苷酸组成,但是核苷酸顺序被打乱,同样要保证它和靶mRNA没有同源性。
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