关键词: mRNA 差别显示
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在PCR 管中加入:
① cDNA样品、P引物、T 引物 各1μl
② 准备其它 PCR试剂的混合液:(在另一管中加入)
③ 将17μlPCR混合液加入各反应管,则各管总体积为20μl。
④ 开始PCR扩增。
⑤ PCR循环参数:
在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序:
⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。
4.电泳和放射自显影
① 配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶,灌注测序板。
② 预电泳30min。
③ 每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中,加5μl loading buffer,混匀,离心,置94℃变性2min。立即置冰浴。
④ 停止预电泳,冲洗加样孔。
⑤ 加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
⑥ 下胶:(同测序胶)
⑦ 干胶:在胶表面覆上保鲜膜,80℃干胶30min。
⑧ X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
5.差异条带回收再扩增
① X光片经D72显影、酸性定影液定影后,水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
② 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带,加ddH2O 20μl,沸水浴15min,离心取上清为模板。
③ 以原引物扩增:
执行PCR程序:
93℃3min;93℃1min→60℃1min→68℃2min,20次循环;68℃5min。
取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
PCR产物乙醇沉淀,10μlddH2 O溶解。
6.以PCR产物为探针,标记后进行Northern杂交,证实基因的真实性。
7.PCR产物的TA克隆。
8.DNA序列测定。
9.检索分析。
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