一、目的
1.了解ATP生物合成的意义。
2.掌握无机磷的测定方法。
3.掌握DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成。
二、原理
在适当条件下,酿酒酵母分解发酵液中的葡萄糖,释出能量,同时还利用无机磷,使AMP转变成ATP,一部分能量即贮存于ATP分子中。因此,在发酵过程中,可测得发酵液中的无机磷含量降低和ATP含量的上升。
三、实验器材
1.酿酒酵母,新鲜酿酒酵母悬浮于蒸馏水中,离心,弃去上清液。如此用蒸馏水洗涤酵母数次,最后将洗净的酵母沉淀冷冻保存①。
2. AMP、 ATP标样
3.烧杯50 或100ml (1)。
4.电子分析天平。
5.水浴锅。
6.离心机4000rpm
7.722型(或7220型)分光光度计。
四、实验试剂
1.2%三氯醋酸溶液:2g三氯醋酸,溶于100 ml蒸馏水。
2.过氯酸溶液:0.8 ml过氯酸,加蒸馏水8.4 ml
3.阿米酚试剂:称取阿米酚[amidol,二氢氯化-2,4-二氨基苯酚,分子式: (NH4)2C6H3OH・2HCl]2g,与亚硫酸氢钠(NaHSO3)40g共同研磨,加蒸馏水200ml,过滤贮棕色瓶内备用。
4.钼酸铵溶液:20.8g(NH4)6Mo7O24%26#8226;4H2O,溶于蒸馏水并稀释至200ml.
5.1mol/L KOH溶液。
6.1mol/L HCl溶液。
7.ATP溶液:称取ATP晶体(或粉末)50mg,溶于5.0ml蒸馏水,临用时配制。
8.DEAE-纤维素薄板:参看辅助试验。
9.1mol/L NaOH溶液。
10.0.05mol/L pH3.5柠檬酸钠缓冲液:见辅助试验。
五、操作
1.发酵
将0.1g KH2PO4及0.58g K2HPO4溶于3ml蒸馏水。
另将0.1g AMP溶于1ml蒸馏水,倾入上述磷酸钾溶液内,加热至37℃。酵母液5ml,再加4ml蒸馏水稀释,加热至37℃,倒入上述溶液中,再加MgCl2 0.016g及葡萄糖0.5g,再加蒸馏水3ml,混匀,立即取样0.2ml,检测AMP及无机磷的含量。
此时测得的磷称为初磷。薄板层析图谱上只有AMP斑点,无ATP斑点。以后每隔30min取样测定,至明显看出无机磷及AMP含量下降、ATP含量上升即可(约2h~3h)。
2发酵液样品处理
将所取之0.2ml样液置离心管中,立即加入2%三氯醋酸溶液1ml,摇匀,离心(3000r/min)10min。上清液用以测无机磷及ATP含量。
3.无机磷测定
吸取上清液0.3ml置于干试管内加过氯酸溶液8.2ml、阿米酚试剂①0.8ml、钼酸铵溶液0.4ml,混匀,10min后比色测定A650nm。
本实验无需求出无机磷的绝对量,故不作标准曲线。A650nm数值下降即表示无机磷下降。一般情况下,当A650nm下降至比初磷A650nm小0.2单位时,发酵液中既有较多的ATP。
4.DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成:方法见辅助试验,同时用ATP溶液作对照。
最好放在低温冰箱冷冻结冰。经深冻得酵母,发酵效果好。
阿米酚试剂为还原剂。如用抗坏血酸,效果不好。
辅助试验
一、目的
掌握DEAE―纤维素薄板层析法测定核苷酸的原理和方法。
二、原理
二乙氨基乙基纤维素,简称DEAE―纤维素,结构式如下:
带负电荷的核苷酸离子就被交换上去。控制溶液的pH,使各种核苷酸所带净电荷不同,与DEAE―纤维素的亲和力也就不同,从而达到分离的目的。
三、实验器材
1. 玻璃片4×15cm(×4)。
2. 尼龙布。
3. pH试纸(pH1~14)。
4. 电动搅拌器。
5. 水平板。
6. 水平仪。
7. 铅笔。
8. 紫外分析仪(254nm)。
9. 电吹风。
10. 烧杯1 000ml(×1)。
11. 吸滤瓶1 000ml(×1)。
12. 布氏漏斗%26oslash;20cm(×1)。
13. 微量点样管10%26micro;l(×1)。
四、实验试剂
1. 核苷酸样品。
2. DEAE―纤维素(层析用)。
3. 1mol/L NaOH溶液。
4. 1mol/L HCl溶液。
5. 0.05 mol/L柠檬―柠檬钠缓冲液(pH3.5):称取柠檬酸12.20g,柠檬酸钠6.70g,溶于蒸馏水,稀释至2 000ml。
五、 操作
1.DEAE―纤维素的处理
先用水洗,抽干后用4倍体积1mol/L NaOH溶液浸泡4h(或搅拌2h),抽干,蒸馏水洗至中性,再用4倍体积1mol/L HCl浸泡2h(或搅拌1h)抽干蒸馏水洗至pH4备用。
2.铺板:将处理过的DEAE―纤维素放在烧杯里,加水调成稀糊状,搅匀后立即倒在干净玻璃板上,涂成均匀的薄层,放在水平板上,自然干燥或60℃烘干,备用。
3.点样:在已烘干的薄板一端2cm处用铅笔轻划一基线,用微量点样管取样液10%26micro;l②,点在基线上,用冷风吹干。
4.展层:在烧杯内置pH3.5柠檬酸钠冲液(液体厚度约1cm),把点过样的薄板倾斜插入此烧杯内(点样端在下),溶剂由下而上流动,当溶剂前沿到达距离玻板上端约1cm处(10min左右)取出薄板,用热风吹干,用260nm紫外线照射DEAE―纤维素层观看斑点。DEAE―纤维素经处理可反复使用。此法具有快速、灵敏的特点
① 如长期不用,需于60℃以下烘干保存。
② 可用腺三磷粗品或药用腺三磷结晶作样品,样液核苷酸浓度为每毫升5mg左右时,点样量为5~10%26micro;l。可按此标准控制点样量。