T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。
优点:
1、没有连不上的,只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题,所以,理论上任何两条DNA序列都能连接在一起,当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利,因为平末端自然是这样,而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端,也可以经过处理成为平末端。
2、有时候,两个平末端连接在一起以后,可以产生另一种内切酶的识别序列,为后续的克隆工作提供了一种机会。
缺点:
1、连接效率比粘性末端低:连接效率之所以比较低,原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用,缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用;原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。
2、可能产生双向插入:由于平端连接的末端没有特异性,连接的时候不能定向,所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定,当然,具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。
3、可能多拷贝插入:平端连接时,可能目的片段多个插入,并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接,导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大,多拷贝插入的可能就越小。
平端连接要求的条件:
1、低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2、不存在亚精胺一类的多胺。
3、极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。
4、高浓度的平端。
实验试剂:
凝聚剂: 在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中,这些物质具有两作用:
1、它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级,因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
2、它们可以改变连接产物的分布,分子内连接受到抑制,所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样,即使在有利于自身环化(j:i=10)的DNA浓度下,所有的DNA产物也将是线状多聚体。
聚乙二醇(PEG8000):
1、用去离子水配制PEG8000贮存液(40%)分装成小份,冰冻保存,但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中,对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外,其他所有连接混合物的组分应于0℃混合,然后加适当体积的PEG 8000(处于室温),混匀,加酶后于20℃进行温育。
2、连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著,甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低,都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3、浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍,反应的主产物是串联的多联体。
4、PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接,在这一方面,它与氯化六氨合高钴有所不同。