本质上,任何分析蛋白质磷酸化位点的方法都要依靠对所研究磷酸化蛋白质的纯化,用酶或化学方法水解磷蛋白,分离、分析产生的磷酸肽。幸运的是,前面部分所述的用于处理丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法同样适用于磷蛋白的分析。所以,用于产生磷酸肽样品的方法是:用凝胶电泳分离蛋白质,水解蛋白质条带或蛋白斑点,提取产生的磷酸肽混合物作进一步分析。虽然磷蛋白在 SDS-PAGE的迁移通常比其非磷酸化的蛋白慢,但是,在一维胶上着到两条迁移非常接近的条带.或在 2- DE 上观察到.系列有相同分子质量但不同等电点的斑点,这样的现象并不足以确定某一个蛋自是磷酸化蛋白。用32p 标记后放射自显影,或磷储屏分析 (storage phosphorimaging). 或用 Western 印迹方法鉴定磷蛋白的结果较为确定、可信。用现有的方法在常规实验中就可将32p放射标记物掺入体内或体外磷酸蛋白质中。分子放射标记方法用于体内磷酸化蛋白质标记,要标记的细胞或组织与32PO4孵育一段时间,使细胞 ATP 库与32p平衡。放射标记的 ATP 被蛋白激酶用于磷酸化其底物。体外蛋白质磷酸化的激酶反应用[γ-32p] ATP 作为放射标记物来源,粗分的细胞裂解液或纯化的激酶作为激酶活性来狠。 Western印迹在检测酪氨酸磷酸化蛋白方面特别成功,因为已经开发出一系列非常灵敏的酪氨酸磷酸盐特异性抗体, 同时也因为此方法没有放射性同位素标记,泛磷酸特异性抗体或磷酸-丝氨酸和磷酸-苏氨酸特异性抗体的开发还不太成功。