标签: 等电聚焦 蛋白质组学:从序列到功能第三章
来源:《蛋白质组学:从序列到功能》
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将所需 pH 范围的 IPG 平板胶在 GelBond PAGfilm (图3. lb) 上聚合,之后,凝胶用去离子水全面冲洗 (6X 10min), 浸人在 2% (m/V) 甘油中 (30min), 常温下在洁净橱中干燥,然后用塑料膜覆盖,如果凝胶不立即使用,可在-20℃ 贮存一年。用前,用切纸机从 IPG 平板胶切下所需数目的干胶条(图 3.lc) 。此外,各种 pH范围商品化的预制 IPG 胶条可购得。可用不同长度的 IPG 胶条,但要切记的是,通常分离区域越大,能分辨的蛋白质越多。 18 或 24cm 胶条通常用于高分辨分离,而短胶条 (4cm, 7rm 或 11cm) 则应用于快速筛选。有大量不同宽或窄 pH 梯度范围条件可供选用于 IPG IEF。
用于2-DE 时,胶条应该散于重泡胀池(图 3, ld) 中在含 5mol/L 尿素的溶液(或2mol/L 硫脲和 5mol/L 尿素)中泡胀。溶液其成分为 0,5% 到 4% 非离子(NP-40,Triton X-100) 或两性 (CHAPS) 去污剂、 15mmol/LDTT 和 0.5% 适宜范围的 pH 值的SCA。然后将胶条直接放在水平平板电泳装钮的冷却板装面 (图 3.lg) 。另外一种便利的方法是用 Phsmiaria 公司的泡胀托架(图 3.lh), 这种托架用波纹塑料板塑造,上面所含的凹槽正好适于 IPG 的排列摆放。此外,该设备配备有带有电极条和框架 (bar) 以及配备加样杯的支架。 可以在胶条表面任意位置加样。必要时,可以将托架用硅油覆盖,以在 IEF 时保护胶条使之不受大气影响。在 2-DE 图谱碱性端常可以见到水平条纹,特别是当在一向使用碱性 IPG 梯度时,在 IPG 胶表面沿阴极区额外叠加一个用 20mmol/L DTT 浸泡过的电极条,可以解决这个问题。该方法的优点是, IEF 时胶内 DTT 向阳极迁移,从阴极区外加电极条释放出来的 DTT 可以不断进行补充。另外一种避免阴极区条纹的方法是利用不带电荷的还原剂 TBP, 它在 IEF 时不发生迁移,已发现在 IEF 中 TBP 可以大大提高蛋白质的溶解能力,特别是羊毛蛋白。
样品通常是加在放置在 IPG 胶阳极区或阴极区的硅橡胶框内或特殊加样杯内(图3. lg, h), 对不同类型的样品,最好的加样位置由经验值确定。最初电压卫限制在150V 、 30min, 从而使尽队多的样品进入加样杯,然后逐渐增加电压至3500 V 。运行时间决定了几个不同的因素,包括样品类型、蛋白上样量、 IPG 胶条长度及所用 pH 梯度 因为温度低时尿素可能会结晶,IEF 应当在 20℃运行,不同的温度下在 2-DE 图谱中 此蛋白质点们相对位置会发生变化。表 3.1 中列出了一些典型的运行条件。上面的加样方法会导致蛋白质沉淀,上样量较大时 (1mg 或更多)更为显著。将IPG胶条直接在含所分析样品泡胀液中泡胀可以克服这个问题。利用该方法可以成功分离很高样品量 (>10mg), 但可能存在高分子植蛋白,极碱性和膜蛋白的选择性丢失。最近研制成功的集成化设备 IPGphoc, 简化了一向 IPG IEF。该设备的特点是可以在加样品或不加样品时在持胶器 (stcip holdc,) 中对胶条进行重泡胀、选择上样量以及随后的 IEF,、所有这些都可以在胶放入容器后设置桯序自动进行。仪器可以同时放12 个持胶器并配备珀尔帖,电了晶体管自动冷却装置,高达8000V 电压的程序化设置和l.5mA 的电源供应(图 3. li), 表 3.2 列出一些利用 IPG phor 的典型的 IPG IEF 运行条件。在重泡胀时加低电压可以提高高分子质量蛋白质的渗入效率。
对一新样品,常最先使用宽范围、线性PH3.5-10梯度 但对大多数样品,这样做会丧失 pH4-7 区域的分辦率,许多蛋白质的 pI 值在该区域。利用非线性 pH3.5-10 IPG IEF 胶在一定程度缓解这个问题。 PH3.5-10 非线性胶条在 pH4-7 区域的梯度要比 pH7-10 更为平坦,保证大部分碱性蛋白质都能得到分离的前提下, pH4-7 区域得到更好的分离(图 3.2) 但用 pH4-7 的 IPG IEF 胶则能在该范围得到更好的分离效果(图 J,J) 这些 pH 范围的胶条目前已经商品化, 实验室自制 pH4-9 的 IPG 胶也能覆盖来自许多不同种类样品的大多数蛋白质。这些梯度的 IPG 胶与加样杯上杆或胶内泡胀兼容,仕 Muhipho, 和 IPG phor系统都工作良好 均适用于分析胶(上样量 50-100μg) 或微量制备胶(上样量至 1mg )典型运行条件如表 3.1 和 3.2 所示。
当分析真核细胞提取物一类复杂的样品时,由于空间分辨率所限,而且高丰度蛋白质存在时低拷贝数蛋白质显色困难,使得单一宽范围 pH 梯度 IFF 只能显示该细胞提取物全蛋白质组的一小部分。可以克服真核及组织蛋白质表达高动态范围和多样性问题的一种方法是进行样品前期分级(见 4.4) 。 另外一种有效的方案是利用复合重叠窄范围IPG 凝胶,跨度在 1-1.5pH 单位,该方法被称为“放大胶" (zoom gel)、复合胶或亚蛋白质组学 ( subproteomics)。 此外,也可用 24cm 的宽胶条。 pH4-7 之间的窄范围胶可用胶内泡胀或加样杯上样,在 Multiphor 或 IPGphor 仪器上运行(图 3.4) 。 这些凝胶是用于毫克上样量微量制备的理想选择,但制备胶需要加长聚焦时间,见表 3.1 和表 3.2) 。强碱性蛋白质如核糖体和核蛋白的 PI 值在 10.5 到 11.8 之间,可以用 pHl0-12 或pH9-12 窄范围 IPG (图 3 . 5) 分离,要获得高重复性的 2-DE 图谱,必须对 pH 梯度生成和凝胶组成进行不同的优化,如用 N, N'-二甲基丙烯酰胺取代丙烯酰胺,并在 IPG 泡胀液中加入异丙醇,从而抑制容易导致大量胶上条纹的反向电渗流 。 必须要用加样杯在阴极上样,且 IEF 要在硅油下进行 。从基因组序列计算获得的理论 2-DE 图谱显示全细胞裂解所获得的大部分蛋白质等电点在 pH4-9, 但同时相当一部分蛋白质等电点可以达到pH12。在经典 2-DE 中这些蛋白质只能用 NEPHGE 分离(见 3)' 但用 IPG IEF 很容易将这些蛋白质分开 。
具体作法是用上文所提到的窄范围 pHl0-12 或 pH9-12 的 IPG,但为了要获得某个细胞或组织蛋白质组的全貌,要先制备覆盖 pH3-12 和 pH4-12 的宽范围 IPG。 目前已获得细胞和组织提取及 TCA/丙酮沉淀蛋白质时通常在裂解缓冲液提取中缺失的 PI 值大于 10 的碱性蛋白质以及肺支原体中不溶于 Triton X-100 的细胞成分的良好的 2-DE 图谱。此外,在 pH9 和 pH12 间含一个平缓区的 pH4-12 IPG 可以对如核糖体蛋白质类强碱性蛋白质获得极好分离。 这些宽梯度可以在不含异丙醇的标准条件下运行,因为此时超过 pH10 的窄 IPG 胶中水合离子向阴极的强烈转移(反向电渗)特性可以忽略不计。此外,高分子质量蛋白质的渗入和聚焦也得到了明显改善(图 3.6) 。利用经典 O'Farrell 系统可以在宽分离距离(每个方向上超过 30cm) 上获得复杂蛋白质谱的最大分辨率。但是,若用 IEF 管胶技术,其成功则伴随着凝胶操作和处理过程中方便性的丧失。与此对比,在塑料支持膜上聚合的长 IPG 胶的处理不需要特殊注意之处 。 如覆盖 pH3-12 和 pH4-12 范围的 24cm IPG 胶条已成功使用(图 3 .6) 。此外,利用窄范围 pH 值(如 pH5 - 6) 的 24cm 长 IPG胶条可以获得高分辨 2-DE 图谱(图 3.7) 。
理论上讲,要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是 IEF 分离达到稳定态所需的时间 。 若聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹,但要避免过度聚焦 。 虽然与经典 O'Farrell 法相比,不会导致蛋白质向阴极的迁移(阴极漂移),但却会因为活性水转运而导致过多水在 IPG 胶表面渗出(电渗), 会造成蛋白图谱变形。在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白质丢 失。 最佳聚焦时间必须根据不同蛋白质样品、蛋白上样量和所用特定 pH 范围及 IPG 胶条长度通过经验来确定。作为指导,表 3.1 和友 3.2 给出了针对一系列不同宽和窄 pH 范围 IPG 的优化保焦时间。
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