1. 用 0. 5~4 倍柱床体积的 DMSO 溶解肽。
2. 如下滴定中和肽溶液:每次滴加 1~2 μl 肽合成级的 N-甲基吗啉(原液或以 1:1 至 1:9 稀释于 DMSO 中),然后取出 2~3 μl 稀释于50 μl 水中,滴加到 pH 试纸上。
重复上述操作直至 pH 为 7~8。
滴定要仔细,因为很容易超过所需的 pH 范围。一般每 3 μmol 肽需要用 7~8 μl N-甲基吗啉滴定,具体的量主要取决于特定的氨基酸序列。取出的等份必须与水混合再测 pH,因为 pH 是测量氢离子的浓度,因此非水溶液无法测量 pH。
3. 将装有 Affi-Gel 10 介质的瓶子摇荡混合以使树脂充分悬浮,取需要量的树脂到带螺口盖的聚丙烯离心管,用 DMSO 洗3次,每次于室温以 700 g 离心 5 min ,吸去上清,重悬于5倍体积的 DMSO 中,然后再次 700 g 离心。
4 . 从树脂上吸取多余的 DMSO,加入步骤 2 配制的肽溶液。室温下旋转混合孵育过夜。
5. 每毫升树脂加入2 μl 乙醇胺,室温下旋转混合孵育 2 h。
6. 按步骤 3 的方法用 DMSO 洗 2 次。
7. 按步骤 3 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl,pH 8.0 洗 2 次(第一次洗涤在冰上操作,因为会产生大量的热量)。第二次洗漆后,吸去洗涤液,换上新鲜的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋转混合孵育过夜。然后低速离心,吸去上清。
8. 按步骤 3 的方法用高盐/高 pH 溶液洗 3 次。
9. 按步骤 3 的方法用高盐/低 pH 溶液洗 3 次。
10. 按步骤 3 的方法用 PBS/叠氮化物溶液洗3次,然后将洗过的树脂储存在 4℃ 以备装填柱子。
11. 用 0.5 mol/L NaCl 将介质制成悬浮液,倒入玻璃层析柱。
12. 依次用 10 倍柱体积的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱体积的 PBS/叠氮化物溶液洗柱。
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