标签: 相互作用阱 双杂交系统 相互作用蛋白鉴定 精编分子生物学实验指南第十九章
通过确定与之结合的其他蛋白质来理解某种特定蛋白质的功能,常常是十分有用的方法。这可以通过从文库中选择或筛选与靶蛋白相互作用的新蛋白来实现。现有一种特别有用的方法即双杂交系统或相互作用阱,用来测定新的相互作用蛋白,这种方法采用充当「试管」的酵母菌和一种报道系统的转录激活作用来识别结合蛋白。本方法也可以用来测试两个预测的具有相互作用的蛋白质之间是否形成复合物。来源于《精编分子生物学实验指南(第五版)》
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实验方法原理 | 捕捉相互作用蛋白的第一步是构建能够表达 LexA 与目的蛋白的融合体的质粒。这种质粒转化到包含 LEU2 和lacZ 报道基因的报道酵母株中,并要行一系列的对照实验来鉴定所构建的诱饵蛋白是否适用,是否需要修饰,或是否应改变酵母菌报道条件。这些对照实验实现了诱饵蛋白在酵母菌中作为一种稳定蛋白质合成、可进入细胞核并与 LexA 操纵子位点结合、不激活基于 LexA 操纵子的报道基因的转录。LexA 融合的诱饵蛋白必须是不能激活其他报道基因转录的在 EGY 48 株(或者相关的 EGY 191)中表达 LexA 融合蛋白不能在缺失 Leu 的培养基上生长,并且在含有 X-gal 的培养基上生长 的克隆是白色的。这种典型的诱饵蛋白质粒被用于在「相互作用蛋白捕获」 中筛选文库中的相互作用蛋白。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 应用标准的亚克隆技术(图 19.1.3),把编码目的蛋白的 DNA 插入到 pEG 202(见图 19.1.3)或别的 LexA 融合质粒中,建立融合蛋白读框。 2. 把以下三组质粒分别用酸锂法转化到 EGY 48 中 pBait+pSH18-34(实验) pSH17-4+pSH18-34(阳性对照) pRFHM1+pSH18-34(阴性对照) 3. 把每个转化混合物放置在 Glu/CM-Ura、-His 缺失平板上。在 30℃ 孵育两天,挑选包含双质粒的酵母。 4. 步骤 3 中每组挑选 5 或 6 个独立的克隆,在 Glu/CM-Ura、-His 缺失主平板上划线,30℃ 过夜。 5. 将尼龙膜放置在酵母培养板上,浸湿,使克隆附着其上。移出膜并在空气中干燥 5 min。将沾有菌落的一面朝上,于 -70℃ 冷冻 10 min。 6. 剪一张比尼龙膜稍大的 Whatman 3 MM 滤纸并浸泡于含 1 mg/ml X-gal 的 Z 缓冲液中。将尼龙膜置于其上,菌落面朝上。或者直接将尼龙膜放在盛有约 2 ml 含 1 mg/ml X-gal 的 Z 缓冲液的培养皿盖中。 7. 在 30℃ 温育并观察菌落颜色的变化。 8. 将以下组合的质粒分别转化酵母菌 EGY 48(三组转化实验): pBait+ pJK101(实验组) pRFHM1 + pJK101(阻遏作用阳性对照组) pJK101 单一质粒(阻遏作用阴性对照) 9. 将每一种转化混合物涂布于 Glu/CM-Ura、-His,或 Glu/CM-Ura 缺失成分培养基平板上,以便适于选择带有指示质粒的酵母菌细胞。30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。 10. 将菌落划线在 Glu/CM-Ura、-His,或 Glu/CM-Ura 缺失成分主平板上,并于 30℃ 培养过夜。 11. 通过液体测定(采用 Gal/CM 缺失成分液体培养基),滤膜测定(步骤 1.5~1.7:从重新划线到 Gal/CM 平板上培养过夜)来检测 3 组转化酵母菌株中的β-半乳糖苷酶活性(实验组、阴性对照组、阳性对照组)。采用滤膜测定 1~2 h;采用 X-gal 平板 24~36 h。 12. 如果诱饵蛋白既不能激活也不能阻遏转录,那么应通过抗 LexA 抗体或抗实验中合成蛋白的融合结构域的抗体对粗制裂解物进行免疫印迹分析检测蛋白质合成。 13. 取一个转化了 pBait 和 pSH18-34 报道质粒的 EGY48 酵母菌单菌落,分散于 500 μl 无菌水中。取出其中 100 μl 稀释于 1 ml 无菌水,并用无菌水作 1:10 的连续稀释至 1000 倍。 14. 从每一个稀释浓度试管(包括未稀释的 10 倍、100 倍和 1000 倍稀释的试管)中各取 100 分别涂布 Gal/CM -Ura、-His 缺失成分培养基平板和 Gal/CM -Ura、-His、-Leu 缺失成分培养基平板,于 30℃ 培养过夜。 在相互作用子捕获实验中实际上是依据诱饵蛋白和酸性融合成对激活 LexA 操纵子-LEU2 基因转录并允许在 Leu-的培养基上生长的能力来进行选择的,而不是单独的诱饵蛋白本身。因此,Leu 需求测试是判断诱饵蛋白是否可能有一个不切实际的高背景的最重要测试。对某些诱饵蛋白而言,EGY 48 中的 LEU2 报道蛋白比 pSH 18-34 报道蛋白更加敏感,因此诱饵蛋白在β-半乳糖苷酶 分析中只有很少或完全没有信号,然而却有些菌可能在 Leu 培养基上生长。如果这种情况发生,有几种操作可以选择,最直接的方法是用一个较不敏感的筛选株 EGY191 替代,然后重复分析。 |
注意事项 | 所有与细胞接触的溶液和设备必须是灭菌的,而且操作时应采用适当的无菌技术。 |
其他 |
实验方法原理 | 捕捉相互作用蛋白的第一步是构建能够表达 LexA 与目的蛋白的融合体的质粒。这种质粒转化到包含 LEU2 和lacZ 报道基因的报道酵母株中,并要行一系列的对照实验来鉴定所构建的诱饵蛋白是否适用,是否需要修饰,或是否应改变酵母菌报道条件。这些对照实验实现了诱饵蛋白在酵母菌中作为一种稳定蛋白质合成、可进入细胞核并与 LexA 操纵子位点结合、不激活基于 LexA 操纵子的报道基因的转录。LexA 融合的诱饵蛋白必须是不能激活其他报道基因转录的在 EGY 48 株(或者相关的 EGY 191)中表达 LexA 融合蛋白不能在缺失 Leu 的培养基上生长,并且在含有 X-gal 的培养基上生长 的克隆是白色的。这种典型的诱饵蛋白质粒被用于在「相互作用蛋白捕获」 中筛选文库中的相互作用蛋白。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 应用标准的亚克隆技术(图 19.1.3),把编码目的蛋白的 DNA 插入到 pEG202(见图 19.1.3)或别的 LexA 融合质粒中,建立融合蛋白读框。 2. 把以下三组质粒分别用酸锂法转化到 EGY 48 中 pBait+pSH18-34(实验) pSH17-4+pSH18-34(阳性对照) pRFHM1+pSH18-34(阴性对照) 3. 把每个转化混合物放置在 Glu/CM-Ura、-His 缺失平板上。在 30℃ 孵育两天,挑选包含双质粒的酵母。 4. 步骤 3 中每组挑选 5 或 6 个独立的克隆,在 Glu/CM-Ura、-His 缺失主平板上划线,30℃ 过夜。 5. 制备 Z 缓冲液 X-gal 平板。 6. 从主平板上挑菌落划线于 X-gal 平板,并于 30℃ 培养。 7. 在接下来的 2~3 天内定期观察平板颜色的变化。 LexA 融合蛋白不能激活转录,通过抑制实验证实 LexA 融合蛋白在酵母中正处于合成状态(有些蛋白质没有合成)并且能够结合 LexA 操作子序列(图 19.1.5)。 接下来的步骤能够同时和激活分析实验同时进行。 8. 将以下组合的质粒分别转化酵母菌 EGY48(三组转化实验): pBait+ pJK101(实验组) pRFHM1 + pJK101(阻遏作用阳性对照组) pJK101 单一质粒(阻遏作用阴性对照) 9. 将每一种转化混合物涂布于 Glu/CM-Ura、-His,或 Glu/CM-Ura 缺失成分培养基平板上,以便适于选择带有指示质粒的酵母菌细胞。30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。 10. 将菌落划线在 Glu/CM-Ura、-His,或 Glu/CM-Ura 缺失成分主平板上,并于 30℃ 培养过夜。 11. 通过液体测定(采用 Gal/CM 缺失成分液体培养基),平板测定(步骤 2.5~2.7,采用 Gal/ CM-Ura X-gal 平板)来检测 3 组转化酵母菌株中的 β-半乳糖苷酶活性(实验组、阴性对照组、阳性对照组)。采用滤膜测定 1~2 h;采用 X-gal 平板 24~36 h。 12. 如果诱饵蛋白既不能激活也不能阻遏转录,那么应通过抗 LexA 抗体或抗实验中合成蛋白的融合结构域的抗体对粗制裂解物进行免疫印迹分析检测蛋白质合成。这些步骤可以与lacZ 激活实验和抑制分析同时进行。 13. 取一个转化了 pBait 和 pSH18-34 报道质粒的 EGY48 酵母菌单菌落,分散于 500 μl 无菌水中。取出其中 100 μl 稀释于 1 ml 无菌水,并用无菌水作 1:10 的连续稀释至 1000 倍。 14. 从每一个稀释浓度试管(包括未稀释的 10 倍、100 倍和 1000 倍稀释的试管)中各取 100 分别涂布 Gal/CM -Ura、-His 缺失成分培养基平板和 Gal/CM -Ura、-His、-Leu 缺失成分培养基平板,于 30℃ 培养过夜。 在相互作用子捕获实验中实际上是依据诱饵蛋白和酸性融合成对激活 LexA 操纵子-LEU2 基因转录并允许在 Leu-的培养基上生长的能力来进行选择的,而不是单独的诱饵蛋白本身。因此,Leu 需求测试是判断诱饵蛋白是否可能有一个不切实际的高背景的最重要测试。对某些诱饵蛋白而言,EGY 48 中的 LEU2 报道蛋白比 pSH 18-34 报道蛋白更加敏感,因此诱饵蛋白在β-半乳糖苷酶 分析中只有很少或完全没有信号,然而却有些菌可能在 Leu 培养基上生长。如果这种情况发生,有几种操作可以选择,最直接的方法是用一个较不敏感的筛选株 EGY191 替代,然后重复分析。 |
注意事项 | 所有溶液和与细胞接触的仪器都必须是无菌的,而且操作时应采用适当的无菌技术。 |
其他 | |
实验方法原理 | 实验要经过两次连续大量的酵母菌平板筛选过程。酵母菌含有 LexA 融合探针、报道基因和插入PJG4-5(见图19.1.6)的 GAL 启动子控制下的 cDNA 表达文库。最近,已有可供用于这个系统的文库。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 实验材料、试剂的准备请见「其他」。 1. 将约 20 ml 含 LexA-操纵子-lacZ 表达质粒和 pBait 的酵母菌 EGY 48 或 EGY 191 培养液接种到 Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液体培养基中,于 30℃ 培养过夜。 2. 将培养液稀释到 300 ml Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液体培养基中至浓度约为 2×106 细胞/ml(OD600 约 0. 10),于 30℃ 培养直至培养液密度约为 1 × 107 细胞/ml(OD600 约 0. 50)。 3. 室温下以 1000~1500 g 在低速离心机中离心 5 min,收集酵母菌细胞。菌体重悬在 30 ml 无菌水中,并移至 50 ml 锥形离心管中。 4. 以 1000~1500 g 离心 5 min,弃上清,菌体用 1.5 ml TE/0.1 mol/L 乙酸锂重悬。 5. 取 30 个微量离心管分别加 1 μg 的插入文库 DNA 的 pJG4-5 质粒和 50 μg 高纯度的剪切均匀的鲑精载体 DNA,然后分别加入 50μl 从步骤 4 获得的重悬酵母菌液。 加入的文库和鲑精 DNA 的总体积应小于 20μl,最好小于 10μl。一个典型的文库转化将获得 2~ 3 ×106 个原代转化子。这一转化总共需要 20~30 μg 文库 DNA 和 1~2 mg 载体 DNA。 6. 分别加入 300 μl 40% pEG 4000/0.1 mol/L 乙酸锂/TE 缓冲液,pH 7.5,颠倒混合直至完全混匀,于 30℃ 温育 30 min。 7. 加入 DMSO 至终浓度 10%(每管约 40 μl),颠倒混匀,在 42℃ 加热板上热激 10 min。 8.1 取其中 28 管:每管涂布一块 24 cm×24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板,于 30℃ 培养。 8.2 剩余的 2 管:每管取 360μl 涂布在 24 cm × 24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上。剩余的 40 μl 用无菌水作 1 : 10 的分别等比稀释,再取稀释液 分别涂布在 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,将所有平板置于 30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。 系列稀释将给出一个大约转化的效率,由此可估算所获转化子的值。 9. 将所有生长转化子的 24 cm×24 cm 平板在 4℃ 下冷却数小时,使琼脂变硬。 10. 戴上手套,使用无菌玻璃显微镜载玻片,轻轻地从平板上将酵母菌细胞刮下来。将 30 个平板上刮下来的细胞收集到 1 或 2 支 50 ml 无菌的锥形试管中。 11. 用 1 体积或至少与转移细胞体积相等的无菌 TE 缓冲液或水洗涤细胞,室温下以 1000~1500 g 离心 5 min,弃上清后重复洗涤 1 次。 12. 用 1 体积的甘油溶液重悬沉淀的酵母菌细胞,混匀后分装成每份 1 ml,于 -70℃ 可保存 1 年。 13. 复活酵母细胞时,用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基将一份冻存的转化酵母细胞作 10 倍稀释,于 30℃ 摇床温育 4 h,诱导文库上的 GAL 启动子。 14. 接着用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基系列稀释酵母菌细胞。涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,于 30℃ 培养 2~3 天至长出可见的菌落。 15. 计算菌落数,推算出每一等份被转化的酵母菌的菌落形成单位(cfu)数。 16. 基于铺板效率解冻适当数量的转化酵母菌,按照步骤 13 稀释,培养。为了获得 107 细胞/ml 的浓度(OD600 约等于 0.5),按需要将转化酵母菌培养液稀释到 Gal/ Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养液中。按总转化子数计算所需的平板数,并以每平板 100 μl 涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺 失成分培养基平板上。于 30℃ 培养 2~3 天直至菌落出现。 17. 小心地挑取适当的菌落接种到一个新鲜的 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养基主平板上,于 30℃ 培养 2~7 天至菌落出现。 挑出在第 2 天长出的菌落接种到一个主平板上,第 3 天长出的菌落接种到一个第二主平板上,而 第 4 天长出的菌落接种到一个第三主平板上。如果获得了许多明显的阳性菌落,那么用在第 4 天(及以后数天)可能获得更大数目的菌落制备主平板。 18. 再从 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培养基主平板上挑菌落转至 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基主平板上,于 30℃ 过夜培养至菌落形成。 19. 从这个主平板上挑菌划线或影印在以下平板上: Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 这个时候,如果菌落在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈蓝色但在 Glu/X-gal 平板上不变蓝或仅呈很弱的蓝色,并且菌落在 Gal/Raff/CM-Leu 平板上生长而不能在 Glu/CM-Leu 平板上生长,那么所获得的菌落和文库质粒可暂定为阳性。 以下步骤用以测定 Leu +插入的 Gal 依赖和 lacZ 表型来证实这是因为文库编码蛋白表达的结果。在诱导之前关闭了 GAL1 启动子并排除了 -Leu 选择。 20.1 按直接电穿孔方案将酵母菌质粒直接转移到 E.coli 中,接步骤 22。 20.2 通过快速小量制备方案从酵母菌中分离质粒 DNA,并作以下修改:获得水相后,加入乙酸钠(NaAc)至终浓度 0.3 mol/L 和 2 体积的无水乙醇,置冰浴 20 min,以最大速度微量离心 15 min,用 70% 乙醇洗涤沉淀,干燥后用 5 μl TE 缓冲液溶解沉淀。 21. 用 1 μl DNA 电穿孔到 KC 8 细菌中,放置在 LB/氨苄平板上,37℃ 过夜。 22. 划线或复制 LB/氨苄平板上的克隆到细菌确定的极限 A 培养基平板含有维生素 B1 和 Ura、His、Leu,而无 Trp。37℃ 过夜。 23. 用细菌小量制备方案纯化文库质粒。这个阶段不要对获得的 DNA 测序,因为可能分离到的克隆没有相互作用。在完成特异试验后再测序。 因为多种 2 μm 带有相同标志质粒可以在酵母中同时存在,一个单独的酵母有时含有两个或更多不同的文库质粒,而只有其中的一种编码相互作用蛋白。对于每一种酵母菌阳性克隆应至少排选 两个单独的细菌转化子,采用 EfoRI 和 Xhol 消化产生 cDNA 插入片段,并进行琼脂糖微胶电泳来验证两个质粒是否含有相同的插入片段。 24. 在不同的转化实验中,用从步骤 23 纯化的质粒转化已含有下列质粒并生长在 Glu/ CM-Ura、-His 平板上的酵母菌: 含 pSH18-34 和 pBait 的 EGY48 含 pSH18-34 和 pRFHM-1 的 EGY48 含 pSH18-34 和非特异性诱饵蛋白质粒的 EGY48(可选) 25. 将每一种转化混合物涂布在 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基平板上,于 30℃ 培养 2 到 3 天直到菌落长出。 26. 对每个待验证的文库质粒均涂布一个 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培养基的主平板。即从每个转化平板上挑 5 或 6 个单独的菌落接种到 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 平板上,于 30℃ 过夜培养。 27. 从这种缺失成分主平板上挑菌或影印菌落至实际筛选中所用的同一系列的验证平板上: Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 一旦细胞中含有 LexA 诱饵蛋白,真正的阳性 cDNA 应使细胞在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈蓝色但在 Glu/X-gal 平板上不变蓝,而且应能使细胞在 Gal/Raff/CM-Leu 缺失成分平板上生长但不能在 Glu/CM-Leu 缺失成分平板上生长。符合这种标准的 cDNA 即可进行测序(见图 19.1.3 说明中的引物序列)或进行特性分析。那些编码与 RPHF-1 或另一种非特异性的诱饵蛋白相互作用蛋白的 cDNA 应该丢弃。 从 cDNA 数据库中对照查询被认为是假阳性的分离 cDNA 也许是有益的。 28. 如果条件合适,可进行另外的特异性验证实验。对阳性分离子进行分析并测序。 用于 PJG4-5 的引物序列在图 19.1.4 中图注中列出。从 KC8 制备的 DNA 即使在用 Qiagen 柱或氯化铯梯度纯化后一般仍不适于进行双脱氧或自动测序。待测序的文库质粒在测序前应该用从 KC8 小量制备的质粒转化一种更适于测序的菌株,如 DH 5a。 |
注意事项 | 1. 所有溶液和与细胞接触的仪器都必须是无菌的,而且操作时应采用适当的无菌技术。 2. 加入的文库和鲑精 DNA 的总体积应小于 20μl,最好小于 10μl。一个典型的文库转化将获得 2~ 3 ×106 个原代转化子。这一转化总共需要 20~30 μg 文库 DNA 和 1~2 mg 载体 DNA。 |
其他 | 携带适当质粒组合(见表 19.1.1 和表 19.1.2)的酵母菌: 含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和 pBait 的 EGY48 含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和 pRFHM-1 的 EGY48 含 LexA-操纵子-lacZ 报道质粒和任一非特异性诱饵蛋白质粒的 EGY48 完全(CM)缺失成分液体培养基,含有如下指示剂的糖 [葡萄糖、半乳糖和(或)棉籽糖][2% (m/V) Glu 或 2% (m/V) Gal + 1% (m/V) Raff(棉籽糖)]: Glu/CM-Ura、-His Glu/CM-Trp Gal/Raff/CM -Ura, -His、-Trp 无菌水 TE 缓冲液(pH 7.5)/0.1 mol/L 乙酸锂 克隆于 PJG4-5 质粒的文库 DNA(见表 19.1.3,图 19.1.6) 高纯度剪切均匀的鲑精 DNA 40% (TTI/V) PEG 4000(过滤除菌)/0.1 mol/L 乙酸锂/TE 缓冲液(pH 7.5) 二甲基亚砜(DMSO) 完全(CM)缺失成分培养基平板,含有如下指示的(20 mg/ml)X-gal 和糖 [2% (m/V) Glu, 2% (m/V) Gal+1 % (m/V) Raff(棉籽糖)]: Glu/CM-Ura、-His、-Trp,24 cm × 24 cm(Nunc)和 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、 -Leu,100 mm Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp,100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu,100 mm Glu/CM-Ura、-His,100mm Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu,100mm TE 缓冲液,pH 7.5 无菌(选用) 甘油溶液 E.coli KC 8 株 E.coli DH 5a 或其他可用于制备供测序用 DNA 的株系 LB/氨苄青霉素平板 细菌确定的极限 A 培养基平板:1×A 平板添加 0.5 μg/ml 维生素 B1,再分别添加 40 μg/ml Ura、His 和 Leu |
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