实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 在一个无 RNase 的微量离心管里混合 200 ug 总RNA、600 ng 5'-生物素化的 oligo-dT25 (5-生物素-dT25)和 300 ul 2× 结合缓冲液。用水调整体积到 600 ul。70°C 加热 5 min, 随后室温放置 15~20 min。
2. 用 0.5 ml 的 1× 结合缓冲液洗涤 150 ul 的链霉亲和素包被的磁珠(见下面步骤 4 关于技术和微量离心管的使用)。磁珠重悬于 50 ul 同样的缓冲液中。
3. 把这些洗过的磁珠,加入含 RNA 的混合物里(步骤 1)室温下轻轻搅动,温育 30 min。
4. 把微量离心管放在磁座上 30 s,然后吸掉尽可能多的上清,不要搅动磁珠或让它们干掉。把管子从磁座上拿下来,加入 0.5 ml 洗涤缓冲液,彻底混勻。重复 2 次以上,最后一次洗后吸掉上清。
5. 把磁珠重悬在 20 ul 12 mmol/L EDTA 中,70°C 加热 5 min 洗脱 poly (A)+ RNA。按步骤 4 用磁座收集磁珠,尽可能快地转移上清到一个新的无 RNase 的微量离心管里,不要吸取任何磁珠。重复一次,总共得到约 40 poly (A)+ RNA。 如果长期保存,加入 0.1 倍体积的 2 mol/L, pH 5.5 的乙酸钠,混匀,加入 3 倍体积的 100% 乙醇,可以无限期地保存于 -20°C。回收时,最高速离心 5 min, 弃掉上清,在旋转蒸发仪上晾干,用双蒸水或缓冲液重悬到原来的体积。
6. 用 5 ul poly (A)+ RNA 溶液连同分子质量参照物一起进行琼脂糖凝胶电泳,检查分离的 poly (A)+ RNA 的产量(平均约 2 ug)和质量。电泳应该在大约 10 kb 以下出现很弱的拖尾(低分子质量)夹杂极少量的 rRNA。
7. 混合以下反应液,合成第一链 cDNA: 10 ul poly (A)+ RNA(约 0.5 ug) 0.5 ul 700 ng/ul 5-生物素-dT25(逆转录引物) 2 ul H2O 4 ul 5× 第一链缓冲液 2 ul 0.1 mol/L DTT 1 ul 10 mmol/L dNTP 0.5 ul 200 U/ul 的 SuperSript II (最后加) 42°C 温育 2 h。
8. 混合以下反应物,进行第二链合成: 20 ul 第一链 cDNA 合成混合物(来自步骤7) 16 ul 5× 第二链缓冲液 1.5 ul 10 mmol/L dNTP 3 ul 0.1 mol/L DTT 7.5 U E.coli DNA 连接酶 25 U E.coli DNA 聚合酶 I 0.8 U RNaseH 加水到 80 ul。 12°C 温育 1 h,然后 22°C 再温育 1 h。用琼脂糖凝胶检查 cDNA 的质量和产量。
9. 用 100 ml 的 2×STEX (技术方面见步骤 4)洗涤 25× 链霉亲和素包被的磁珠。重悬在 80 ul 的 2×STEX 中。
10. 把磁珠悬液加入 cDNA 混合物里,室温轻轻搅动,温育 30 min。
11. 用磁座收集磁珠(步骤4),用 100 ul 的 1×STEX 洗一次,转移到一个新的微量离心管里。用 1×STEX 再洗两次,最后把磁珠重悬在 50 ul 的 H2O 或 10 mmol/L的 Tris·Cl (pH 8.0)/0.1 mmol/L EDTA。
12. 混合下面的反应物: 20 ul cDNA 样本(一般 100~200 ng) 10 U TaqI 限制性内切核酸酶 8 ul 5×RL缓冲液 用水调整体积到 40 ul。 65°C 保温 1 h。
13. 加入如下成分: 10 U MseI 限制性内切核酸酶 2 ul 5× RL 缓冲液 用水调整体积到 50 ul。 37°C 温育 1 h。
14. 混合 8.5 (1500 pmol) 的长链和 8 (1500 pmol)短链用于制备Taql接头。用水调整体积到30 ul。
15. 混合 8.5 ug(1500 pmol)的长链和 8 ug (1500 pmol)短链用于制备 TaqI 接头。用水调整体积到 30 ul。
16. 用 TagI 和 MseI 消化的 cDNA 片段(步骤 12、13)中加入下述试剂: 1 ul 各种接头(各 50 pmol; 步骤 14、15) 1 ul 10 mmol/L ATP 2 ul 5× RL 缓冲液 10 ul H2O 37°C 温育 1 h。加入 1 U T4 DNA 连接酶,37°C温育 2 h。
17. 用 Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mmol/L EDTA 10 倍稀释一小份(2~5 ul)模板混合物(步骤16)。准备如下扩增反应: 5.0 ul 1:10稀释的模板混合物 1.5 ul 各 8 pmol/ul 的 AFLP+0 (非选择性)引物 2.0 ul 5 mmol/L dNTP (每种 dNTP 的终浓度为 0.2 mmol/L) 5 ul 10× PCR缓冲液 1 U Ampli Taq DNA 聚合酶 加水到 50 ul。
18. 在 PE-9600 热循环仪上运行下面的温度循环进行扩增: 20 轮: 30 s 94°C(变性) 60 s 65°C(引物复性) 60 s 72°C (引物延伸)。
19. 取 10 ml 反应混合物和分子质量参照物一起电泳,检查预扩增的情况。 应该看到位于 50~500 bp 之间的,呈拖尾状的弥散产物。
20. 按 1:500 稀释 2 ul 非选择性的预扩增cDNA片段(也就是+0/+0)到Tris· Cl (pH 8. 0)/0.1 mmol/L EDTA。
21. 在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性预扩增反应(+1/+1):
21.1 分装 5 ul 1:500 的非选择性预扩增 cDNA 片段到 PCR 板上的前两列(1和2)的每一个孔中。
21.2 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 T 叫 TaqⅠ+A 到 A1 至 D1 的孔中,1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+C 到 E1 至 H1 的孔中,1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+G 到 A2 至 D2 的孔中,1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+T 到 E2 至 H2 的孔中。
21.3 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ+A 到 A1、A2、E1 和 E2 中,1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ+C 到 B1、B2、F1 和 F2 中,1.65 ul 的 8 pmol/ul 的引 物 MseI+G 到 C1、C2、D1 和 D2 中,1.4 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseI+T 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
21.4 混合 32 ul 5 mmol/L dNTP, 80 ul 的 10× PCR 缓冲液 ,16 U 的 AmpliTaq-Gold 聚合酶,用水调整体积到 672 ul,配制成 dNTP/聚合酶混合液。
21.5 分装 42 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。
22. 运行下面的降落: 温度循环程序进行 AFLP 扩增: 13 轮: 30 s 94°C(变性) 30 s 65°C- 0.7°C/轮(引物复性) 60 s 72 0C (引物延伸) 20 轮: 30 s 94°C(变性) 30 s 56°C(引物复性) 60 s 72°C(引物延伸)
23. 准备下面的磷酸化反应混合物: 2.0 ul 10 uCi/ul (约 2000 Ci/mmol) [33P-γ] ATP 1.0 ul 10× T4 多核苷酸激酶缓冲液 4 U T4多核苷酸激酶 加水到 8 ul。
24. 混合 2.0 ul 8 pmol/ul 的选择性引物(+2)和 8 ul 的磷酸化反应混合物(步骤 23),磷酸化 16 pmol的选择性 TaqI+2 引物(20 个 AFLP 反应所需的量;也就是,对一个给定的 TagI+2 引物,整套 256 种引物组合种所有 16+2/+2 的反应所需的量),产出的标记引物浓度为 12.6 pmol/ul, 终体积 10 ul。37°C 温育 60 min,随后 70°C 加热 10 min 失活激酶。
25. 把 2 ul 各个预扩增产物(+1/+1;22 步)用 Tris·Cl (pH 8.0)/0.1 mmol/L EDTA 稀释 500 倍。在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性扩增反应(+2/+2):
25.1 分装 2 ul 1:500 的预扩增混合液 TaqI+A/MseI+C 到 PCR 板上的前两列。
25.2 分装 0.5 ul 标记的引物:TaqI+AA 到 A1 至 D1 的孔中,0.5 ul 标记的引物 TaqI+AC 到 E1 至 H1 的孔中,0.5 ul 标记的引物 TaqI+AG 到 A2 至 D2 的孔中,0.5 ul 标记的引物 TaqI+AT 到 E2 至 H2 的孔中。
25.3 分装 0.6 ul 未标记的引物 MseI+CA 到 A1、A2、E1 和 E2 孔中,0.6 ul 未标记的引物 MseI+CC 到 B1、B2、F1 和 F2 孔中,0.6 ul 未标记的引物 MseI+CG 到 C1、C2、D1 和 D2 中,0.6 ul 未标记的引物 MseI+CT 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
25.4 混合 12.8 ul 5 mmol/L dNTP, 32 ul 的 10×PCR 缓冲液,6.4 U 的 AmpliTaq- Gold 聚合酶,用水调整体积到 270.4 ul, 配制成 dNTP/聚合酶混合液。
25.5 分装 16.9 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。
26. 按照步骤 22 中的「降落」 PCR 程序扩增产物。
27. AFLP 反应中加入等体积(20 ul)的上样缓冲液。90°C 加热 3 min 变性 AFLP 反应产物,然后快速置于冰上冷却。
28. 测序凝胶系统的后玻璃板用 2 ml 排斥型硅烷处理,前玻璃板用 10 ml 的黏合型硅烷处理。准备 4.5% 的变性聚丙烯酰胺凝胶(约 100 ml)。
29. 用 1×TBE 作电泳缓冲液,上样前预电泳 0.5 h, 使用合适的电泳条件使凝胶加热到约 55°C (如对 BioRd 系统固定 110 W)。用温度计监测凝胶的温度。
30. 每孔上样 3 ul(48 道的凝胶)或 1.5 ul(96 道的凝胶)的样品,约 55°C 电泳分析。 如果需要的话,加上一个分子质量参照物(如 SequalMark 10-base 序列阶梯)。
31. 电泳完成后,卸下凝胶。因为硅胶的处理,凝胶会黏附在前板上。凝胶浸泡在 10% 的乙酸里 30 min 以固定凝胶。用水彻底淋洗凝胶,在通风橱里室温干燥 10~21 h, 或使用较高温度 (如使用温度浴)干燥较短时间直到凝胶不再发黏。
32. 放射自显影或用磷屏显示凝胶分离的 cDNA 片段。
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