标签: 透射电子显微镜 观察准备 支持膜 微生物学实验第三版
显微镜的分辨率取决于所用光的波长,电子束作用于样品的方式及成像原理不同,适用的范围也不同,目前最常用的是透射电子显微镜和扫描电子显微镜。本实验主要介绍透射电子显微镜观察样品前的准备工作。其总放大倍数可在1000~100万倍范围内变化。内容来源于《微生物学实验(第三版)》
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光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。而在透射电镜中,由于电子不能穿透玻璃,只能采用网状材料(载网)作为载物。载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格,其中最常用的是 200-400 目(孔数)的铜网。
本实验选用的是 400 目的铜网。
1. 用醋酸戊酯浸漂几小时,再用蒸溜水冲洗数次,然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。
2. 如果铜网经以上方法处理仍不干净时,可用稀释的浓硫酸(1:1)浸 1~2 min, 或在 1%NaOH 溶液中煮沸数分钟,用蒸馏水冲洗数次后,放入无水乙醇中脱水,待用。
载网在使用前要处理于除去其上的污物,否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。
在进行样品观察时,在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜(支持膜或载膜),否则细小的样品会从载网的孔中漏出去。
支持膜应对电子透明,其厚度一般应低于 20 nm;在电子束的冲击下,该膜还应有一定的机械强度,能保持结构的稳定,并拥有良好的导热性;此外,支持网在电镜下应无可见的结构,且不与承载的样品发生化学反应,不干扰对样品的观察时其厚度一般为 15 nm 左右。
因此支持膜可用塑料膜(如火棉胶膜,聚乙烯甲醛膜等),也可以用碳膜或者金属膜(如铍膜等)。常规工作条件下,用塑料膜就可以达到要求。其中火棉胶膜的制备相对容易,但强度不如聚乙烯甲醛膜。
1. 火棉胶膜的制备
1.1 在一干净容器(烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗)中放入一定量的无菌水。
1.2 用无菌滴管吸 2% 火棉胶醋酸戊醋溶液,滴一滴于水面中央,勿振动,待醋酸戊醋蒸发、火棉胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜。
1.3 用镊子将它除掉,再重复一次此操作,主要是为了清除水面上的杂质。
1.4 然后适量滴一滴火棉胶液于水面,火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关。
1.5 待膜形成后,检查膜是否有皱折,如有,则除去一直待膜制好。
2. 聚乙烯甲醛膜(formvar 膜)的制备
2.1 洗干净的玻璃板插入 0.3% formvar 溶液中静置片刻(时间视所要求的膜的厚度而定),然后取出稍稍晾干便会在玻璃板上便形成一层薄膜;
2.2 用锋利的刀片或针头将膜刻一矩形;
2.3 将玻板轻轻斜插进盛满无菌水的容器中,借助水的表面张力作用使膜与玻片分离并漂浮在水面上。
所使用的玻片一定要干净,否则膜难以从上面脱落;漂浮膜时,动作要轻,手不能发抖,否则膜将发皱;同时,操作时应注意防风避尘,环境要干燥,所用溶剂也必须有足够的纯度。否则都将对膜的质量产生不良影响。
常用方法有二:
法一:
1. 将洗净的网放入瓷漏斗中,漏斗下套上乳胶管,用止水夹控制水流,缓缓向漏斗内加入无菌水,其量约高 1 cm;
2. 用无菌镊子尖轻轻排除铜网上的气泡,并将其均匀地摆在漏斗中心区域;
3. 在水面上制备支持膜(见本实验「制备支持膜」),然后松开水夹,使膜缓缓下沉,紧紧贴在铜网上;
4. 将一清洁的滤纸覆盖在漏斗上防尘,自然干燥或红外线灯下烤干。
5. 干燥后的膜,用大头针尖在铜网周围划一下、用无菌镊子小心将铜网膜移到载玻片上,置光学显微镜下用低倍镜挑选完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。
法二:
制备支持膜(见本实验「制备支持膜」),成膜后将几片铜网放在膜上,再在上面放一张滤纸,浸透后用镊子将滤纸反转提出水面。将有膜及铜网的一面朝上放在干净平皿中,置 40℃ 烘箱使干燥。
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