3. 在 1.5 ml 硅烷化的微量离心管中加入如下溶液制备 NAP-1 和核心组蛋白(NH)的主混合液:
172 HEG
7 ul 300 mmol/L KCl
84 ul PvOH/PEG 溶液
4.2 ul 2 mg/ml BSA
6.4 ul 2 mg/ml NAP-1
3.03 ul 0.7 mg/ml 核心组蛋白
轻轻地涡旋混勻 2~3 S。
4. 吸取 56.6 ul 步骤 2 中的 NH 混合液(室温)分别到 5 个硅烷化的 1.5 ml 微量离心管中。冰浴≥20 min 使组蛋白与 NAP-1 结合。
5. 制备 ATP 与镁离子的主混合液(AM): 3 ul 0.5 mol/L ATP, 30 ul 0.5 mol/L 磷酸肌酸,16.5 ul 蒸馏水,25 ul 100 mmol/L MgCl2。使用前加入 0.5 ul 5 mg/ml 肌酸激酶。
6. 准备 DNA 模板,将下列溶液混合:
7.64 ul 质粒 DNA(0.42 mg/ml)
2 ul 10×拓扑异构酶Ⅰ缓冲液
2.36 uI 重组的拓扑异构酶Ⅰ工作溶液
8 ul 蒸馏水
30℃ 温育 10 min 以使 DNA 松弛;放置于室温备用。
染色质抑制拓扑异构酶Ⅰ对 DNA 的松弛作用。因此,反应中的拓扑异构酶Ⅰ应比经 10 min 的 30℃ 温育后使超螺旋的质粒完全松弛所需的量超出 5~10 倍。纯化的系统在缺少拓扑异构酶时也 可以高效地在线性的超螺旋 DNA 上组装染色质。在后一种情况下,模板必须有高于 95% 的超螺旋 DNA(通过两轮的 CsCl 分带获得)。
7. 用 ACF 稀释缓冲液制备 ACF 稀释液(2~10 U/ul)。置冰上。
1 U 的 ACF 等于 22 fmol 蛋白质。
8. 按如下所述进行 5 个装配反应:
8.1 步骤 3 中的 56.6 ul NH 中加入 1 ul ACF(2~10U)。
8.2 从冰上取下管子,平衡到室温。
8.3 加入 10.5 AM 主混合液(步骤 4),以及 2 ul DNA 模板(使用过量的拓扑异构酶Ⅰ变松弛或超螺旋的;步骤 5)。旋即轻轻涡旋混匀 2~3 S。
8.4 27℃ 装配 1.5~2.5 h。加了所有组分后轻轻地涡旋混匀反应液,短暂地离心一下并收集溶液至管底。加入 DNA 模板后 马上混匀反应液是十分重要的。
9. 在马上使用前,准备两个微球菌核酸酶在缓冲液 R 中的稀释液:1:500 和1:1500。
10. 每个反应中加入 17.5 ul 10 mmol/L CaCl2。将每个反应等分为两份(a 和 b)。隔一定的时间间隔(如 15 s),在 a 管中加入 5 ul 步骤 8 准备好的 1:1500 稀释液,在 b 管中加入 5 ul 1:500 稀释液。室温消化 10 min。
11. 制备终止液(ST):将 55 ul 0.5 mol/L EDTA 与 11 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液 混合。每管中加入 6 ul ST 并涡旋混匀终止微球菌核酸酶的消化。室温放置 5 min 以消化污染的 RNA。
12. 制备蛋白酶溶液(PR):将 1.1 ml 糖原终止缓冲液与 55 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液混合。每管中加入 105 ul PR,涡旋混匀。37℃ 温育 ≥ 30 min,以消化组蛋白及可溶性蛋白。使用 200 ul 50:49:1 酚/氯仿/异戊醇抽提。上层水相加入 25 ul 2.5 mol/L 乙酸铵,475 ul 100% 乙醇沉淀 DNA。