标签: 免疫球蛋白G 精编分子生物学实验指南第五版第十一章
来源:《精编分子生物学实验指南》第五版
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1)于 4℃ 不断搅拌,往 2 体积的抗血清、腹水或组织培养上清中,逐滴加入 1 体积 SAS 溶液。加完后置于 4℃,不间断地搅拌 2〜4 h 以形成沉淀。
2)4℃ 12 OOO g 离心 20 min, 用预冷的溶于 PBS 的 33% SAS 溶液在涡旋混合器上振荡洗涤沉淀,所用溶液的体积与原抗血清、腹水或组织培养上清等体积,重复洗涤。
3)在涡旋混合器上温和振荡将沉淀溶于合适的预冷的缓冲液中(5%〜10% 的原始体积)。
4)4℃透析 IgG 溶液 48 h 以上,期间换 3 次(每次换 4L) 所需缓冲液,以去除硫酸铵。
1)根据制造商的说明准备DEAE-Aff1-Gel Blue柱子。于4℃用5倍柱床体积的加样缓 冲液平衡(7 mL柱床体积/mL抗血清或腹水)。
2)于4℃下透析含1g的样品40 h,中间换2次加样缓冲液(每次换大约4 L)
3)加样上柱,速度为10 mL/h。以同样的速度用3倍柱床体积的加样缓冲液洗脱未结 合的蛋白质。
4)用洗脱缓冲液以10 mL/h的速度洗脱结合的1gG组分。以10 mL为一组分分部收集 洗脱液,并储存于4℃,直至合并各组分。
5) 每组分取30〜50 μl,用10% SDS-PAGE在还原条件下分析,检测含1gG 的组分。
在还原条件下,IgG的重轻链将分开,相应的分子质量分别为50 OOO Da和25 OOO Da。
在这一步可测定污染的转铁蛋白的量,可用凝胶过滤层析法除去。
6) 合并含有IgG的组分,在4℃下透析大于40 h,期间换2次所需缓冲液(每次换 4 L)
7) 用5倍柱床体积的加样缓冲液重新平衡DEAE-Aff1-Gel Blue柱,加少许NaN3晶体阻止细菌生长,储存于4℃。
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