标签: 微量制备 毛细管电泳 精编分子生物学实验指南第五版第十章
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1. 低压下(0.5 lb/in2)用以下溶液冲洗预处理毛细管:
10 倍柱体积的 0.1 mol/L NaOH
10 倍柱体积的水
4 倍柱体积的 0.25 mol/L 磷酸钠缓冲液,pH 2.30。
柱存储于 0.25 mol/L 磷酸钠缓冲液,pH 2.30。
2. 将各 0.2 mg 的 ACTH4-10、血管紧缩素 I 和血管紧缩素 II 溶于 1 ml 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液,pH 2.30(终浓度 = 0.6 mg 多肽/ml)制备多肽混合物。冻存 100 μl 每管混合物于 -20℃。
3. 在 0.5 lb/in2,10 s 内用低压注射上样 10~20 nl 多肽混合物。
4. 使用以下条件分离多肽混合物:
电解质:0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液,pH 2.30
探测波长:200 nm
温度:25℃
电压:25 kV
分部大小:每收集管 3 min
5. 用一系列的含 10 μl 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液,pH 2.30 的微量锥形瓶替换标准的出口池(正极)。收集 3 min 的组分于每一个瓶子以利于了解分离的长度。
6. 重复注射和分离(步骤 3~5)4 次,合并来自相应的组分号码的内容物。
7. 用以前阐述的分析分离法监视多肽内容的组分(见解析多肽分离实验)。
多次收集方法要有效,多肽的洗脱时间必须具有重复性。以下的方法使用P/ACE5000毛细管电泳仪器进行多肽混合物的分离。
1. 制备多肽混合物和预处理柱子(见多次分离步骤 1 和 2)。
2. 在 0.5 lb/in2,10 s 内用低压注射上样 0.1 μl 多肽混合物。
3. 使用以下条件分离多肽混合物:
电压:7.5 kV
4. 用一系列的含 10 μl 4:1(V/V)0.5 mol/L 磷酸钠缓冲液/乙烯乙二醇的微量锥形瓶替换标准的出口池(正极)。收集 3 min 的流分于每一个瓶子用于分析分离的长度。
5. 用分析分离方法(见解析多肽分离实验)筛选含多肽的流分。
对于单收集方法,CE仪器必须能有效地控制在高电压水平时的毛细管温度,因为高电压水平是电泳所必需的。鼓风式冷却通常不适合该目的。
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