实验试剂及仪器具体要求见其他。
1. 如免疫印迹和免疫检测实验所述,电泳分离目标蛋白并转移到硝酸纤维素膜。最好使尽可能多的蛋白质结合到硝酸纤维素膜尽可能最小的区域,这点很重要。
2. 将硝酸纤维素膜放入盛有含 0.1% 丽春红 S 染料的 1% 乙酸水溶液(如 50 ml 用于 8 cm × 10 cm 微型胶)的经酸洗的 Petri 玻璃培养皿。轻轻摇动 1 min。
3. 将膜移入 1% 乙酸 1 min, 如有需要,换液至条带显迹清晰。
4. 戴无粉尘手套用刀片将目标蛋白条带切下,放入微量离心管中,取一片空白膜作对照。本步骤得到的条带也可放入含 0.5 ml 水的微量离心管中,于 -20℃ 保存。
5. 将膜放入 1 ml 0.2 mmol/L NaOH 中,振荡 1 min 脱色,吸去 NaOH。立即加入 1 ml 含 0.5% PVP-40 的 0.1 mol/L 乙酸中,室温下轻轻摇动管子 30 min。
6. 用 1 ml 水洗膜 5 次。小心除去所有液滴(如管帽下的液滴)。
7. 用清洁的细头镊子将膜片转移到干净的玻璃表面(如经酸洗的玻璃平板或 Petri 培养皿),切成 1~2 mm 的小片,用镊子收集膜片,挤去过量的液体。
8. 立即将膜的碎片移入盛有 25 ml 消化缓冲液的 0.5 ml 微量离心管中,加入 1 ml 1 mg/ml 的胰蛋白酶,混匀使膜均匀地泡于溶液中,室温放置过夜。
9. 室温高速微量离心 1 s, 回收粘在管壁和盖子上的液滴。室温超声处理样品 5 min。
10. 室温用最大速度微量离心 1 min, 将上清移入离心过滤装置,用 100 μl 消化缓冲液洗膜碎片,合并于上清,在最大速度微量离心样品 20~30 s。如果不进一步分级分离,可冻结保存样品。
11. 用 95% 层析 A 液/ 5% B 液,以 0.15 ml/min 的流速平衡 2.1 mm × 250 mm 的反相HPLC 柱,如有层析炉,可在 60℃ 进行分离以优化分辨效果。
12. 注射样品,用 95% A 液/ 5% B 液洗柱子 10~15 min。用如下的梯度洗脱多肽:5%~40% B 液 1 h 以上,40%~75% B 液 30 min 以上,75%~100% B 液 15 min以上。在 215 nm 监测多肽的洗脱。
13. 用图形记录仪根据全量程的波形调整至 0.05~0.1 AUFS 监测多肽洗脱峰的出现。尽可能缩小柱子到收集器之间毛细管的长度和容积,聚乙烯酮(PEEK) 管子(内径 0.005 in)有助于达到此目的。
14. 当图形记录仪开始摆动说明有洗脱峰出现时,对一干净的表面(如 Kimwipe 或前面的收集管)擦毛细管的尖,用微量离心管收集这部分组分,马上盖上盖子置于干冰。
15. 比较样品和空白硝酸纤维素膜的色谱图,鉴定源于目的蛋白的多肽相应的峰。加样于按 Applied Biosystems 所述方法经 Polybrene 预处理的玻璃纤维滤膜支持体中,进行测序。
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