1. 用 20-G 或 22-G 的注射针,往小鼠腹腔内注射降植烷,每只鼠 0.5~1 ml,1 周后接种细胞。
2. 在 175 cm2 培养瓶中加完全 DMEM - 10 / HEPES /丙酮酸钠培养液,进行杂交瘤细胞的培养,使细胞生长至对数期。
3. 将培养液转入 50 ml 锥形离心管中,室温下 500 g,离心 5 min。弃上清。
4. 细胞重悬于 50 ml 无菌的 PBS 或 HBSS ( 不含 FCS ) 中洗涤。于室温下 500 离心 5 min , 弃上清。重复 2 次,然后细胞重悬于 5 ml 的 PBS 或 HBSS 中。计数细胞,通过台盼蓝排除法确定细胞活力,细胞应该有接近 100 % 的存活力。
5. 用不含 FBS 的 HBSS 或 PBS 调整细胞浓度至 2.5 × 106 细胞/ml。用一个 10 ml 的无菌的带 22-G 针头的注射器,对裸鼠进行腹膜内注射 1 ml 细胞,同时注射 3 个裸鼠。等待腹水形成(1~2 周)。
6. 收获腹水。一只手抓住并固定小鼠,使其腹部皮肤绷紧。另一只手将一只 18-G 的针头插入小鼠腹腔 1~2 cm 深。进针部位为左下腹或右下腹,以避免刺入鼠上腹部的重要器官,以及腹中线处的主要大血管,将腹水滴入一只无菌的 15 ml 聚丙烯锥形离心管中。
7. 如果腹水出现凝块,可用一小木签沿着凝块的周围(位于凝块与管壁之间)挑一下凝块使之解体,然后再离心。凝块可能会粘在小木签上然后移走,也有可能一直在管内离心后组成沉淀。
8. 在室温下,1500 g,离心腹水 10 min, 收集上清,弃沉淀,将腹水存放于 4℃,直到收集腹水的工作完成(在 1 周内)。
9. 让小鼠再次积累腹水(2~3 天),再次收获腹水。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集,或者小鼠健康状况不佳。此时,可处死小鼠。
10. 把在几天内收集到的腹水汇集到一起,于 56℃ 水浴 45 min 进行热失活。如果凝块形成,可参照步骤 7 中方法去除之,然后再离心。
11. 采用适当的方法检测腹水中的 MAb 的滴度。MAb 的饱和浓度(最大活性)应该达到 0.5 % 或更高稀释度。MAb 滴度偏低的原因常为杂交瘤不稳定,从而停止产生 MAb, 或者由于杂交瘤在体内连续多次传代(2 次以上)所造成的。
12. 按大于 1:10 的比例稀释 MAb,并通过 0.45 滤膜滤过除菌。分装并冻存于 -70℃, 避免反复冻融,可冻存数年之久。如果腹水不是用来进行生物测定,那么可加入叠氮钠至 0.02 % 的终浓度。
|