标签: 羟磷灰石层析法 核心组蛋白 纯化 精编分子生物学实验指南第五版第二十章
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1. 用 25 ml HAP 重悬约 2 ml 精核(约含有 6 mg DNA),4℃ 轻轻搅动 10 min。
2. 边搅动,边加入 10 g BioGel HTP 干粉。
3. 加入足够的 HAP 缓冲液使成浆状,并加入到 2 cm×15 cm 柱中,收集洗脱液。
4. 用 10 体积的 HAP 缓冲液洗涤树脂(约 300 ml 以 30 ml/h 的速度)。
5. 用含有 2.5 mol/L NaCl 的 HAP 缓冲液洗脱核心组蛋白,每 8 ml 收集一管。
6. 测量 A230 或 A280 值或者使用蛋白质定量系统,确定蛋白质的浓度,将同一蛋白质峰的成分合并。
组蛋白 A230 的消光系数(虽然计算源自鸡的红细胞组蛋白,但是与哺乳动物组蛋白的相近)为 4.3 U/mg 组蛋白/ml。另外,Bio-Rad 或其他蛋白质定量系统可以通过以 BSA 为标准测得。使用 BiaRad 蛋白质定量系统测得的浓度比使用 A230 的方法高 1.6 倍。
7. 通过测定传导读数确定已合并的每个库成分的盐浓度。盐浓度应为 2 mol/L 左右。
8. 如通过 SDS-PAGE 确定核心组蛋白的纯度。
9. 如有需要,使用 Centriprep-10 浓缩器浓缩核心组蛋白至浓度为 2~10 mg/ml。
10. 分装液体,在干冰上速冻,可在 -80℃ 保存 4 年左右。
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