标签: 哺乳动物 精核 制备 精编分子生物学实验指南第五版第二十章
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1. 培养并收获 3L 1×106 细胞/ml 的哺乳动物组织培养的细胞(如 HeLa), 用 1L PBS清洗两次。
2. 用 20 倍于沉淀体积(40 ml) 的裂解缓冲液重悬细胞沉淀,转移到杜恩斯匀浆器中,用 B 型研磨棒研磨 15 次以裂解细胞。在显微镜下观察裂解液。
3. 4℃,3000 g 离心 15 min。
4. 使用裂解缓冲液重复重悬及离心两次,再用缓冲液 B 重复一次。在最后一次离心之前,将重悬液用 2 mol/L NaCl 稀释 10~30 倍,测量 A260 值,估计核 DNA 的总量。
5. 用 2 倍于沉淀体积的缓冲液 B 重悬得到的核,测量重悬液的总体积。
6. 轻轻搅动,一滴一滴地加入 1 体积的缓冲液 B/0.6 mol/L KCl/10% ( V / V ) 甘油。
4℃ 连续轻轻搅动 10 min。如有需要轻轻匀浆。
7. 4℃, 17 500 g 离心回收精核 30 min。精核在液氮或干冰中速冻,并且可在 -80℃ 储存一年以上。
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