实验步骤 | 胚胎干细胞(hES) 培养基 BRL-条件培养基(见 2. 2. 5 节) ..................................... 60ml BRLM/20F B (l 2.2.4f ) ......................................... 40ml LIF (ESGRO ), IX IO6U/袋............................. 100M1, 1000U/ml 2. 2. 2 人胚胎干细胞玻璃化冻存和解冻的培养基 2. 2. 2. I h E& H E PE S 培养基 含 有 GIutamax的 DMEM,不含丙酮酸钠................................ 16mI ESFBS [ E S 级 别 胎 牛 血 清 ] .............................................4ml H EPES, lmol/L .................................................... 0.5ml 2.2. 2.2 0.2mol/L 虞糖溶液 鹿糖, lmol/L ........................................................ Iml hES-HEPES ............................................................. 2- 2. 2_ 3 0•lm ol/L 篇糖溶 液 鹿糖, lmol/L ...................................................... 0. 5ml hES-HEPES 培养基............................................... .. 2.2. 2 _ 4 玻 璃 化 培 养 基 , 10% hES-HEPES 培养基...................................................... 乙 二 醇 ............................................................ 0. 25ml DMSO ............................................................ 0. 25ml 2.2.2.5 玻 璃 化 培 养 基 , 2〇 % hES-HEPES 培 养 基 ................................................. 75ml 蔗糖溶液, lmol/L ................................................ 0.75ml 乙 二 醇 ..............................................................0.5ml" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1471944792367dcazsmwcpfpng_small.jpg" style="width: 550px; height: 626px;" /> 2.2.5 BRL-条件培养基 B R L 细胞在大鼠肝细胞培养基(BRL-CM) 中生长至汇合,用新鲜培养基更换一次 , 3 天后收集这些培养基。 所有培养基用无菌的、孔 径 0.2um 的 P E S 滤膜过滤,特别是来自其他细胞类型的条件培养基。应该注意的是:在细胞分化研究中可能被用到的生长因子和其他小分子需要无菌准备,但不能过滤,以免这些物质与滤膜结合而被损耗。 |
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实验步骤 |
2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(MEF) 的 制 备 最广泛地用于支持 h E S 的伺养层细胞来自小鼠胚胎 [丁]^〇 1113 〇 1161&1,, 1998;Reu-binoffetal. , 2000],如小鼠胚胎饲养细胞(MEFs) ,尽管它们可能是最原始的间叶细胞的前体细胞。 每一 种 h E S 细胞系在不同的词养层细胞上的生长可能不同,这点要注意,对于高效率的增殖有些饲养层细胞比另外一些细胞更合适,通常要传 5〜10代以确保细胞适应于新的伺养细胞。始终要做到只要细胞培养标准条件改变,就要对细胞的核型稳定性和多能性进行严格的核查。方 案 2. 1 介绍了原代 M E F 细胞的分离培养。 2.3.1 原代培养 小鼠胚胎饲养细胞能够从妊娠〗15.5 —— 16.5 天 的 小 鼠 胚 胎(E15.5〜E 16.5 ) 中分离出来,培养过程易于生长,是一种可靠的、持 续 的 饲 养 细 胞 的 来 源 ,并能在液氮中维持很长时间。 MEFs 通常是在复苏之后 2〜5 天使用。方 案 2 . 1 是 由 N agy 等人的方 案 修 改 而 来 [2003] 方 案 2.1 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(M E F s) 的 原 代 培 养 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ MEFM (见 2. 2. 3) □ 无 Ca2+ 和 Mg2+ 磷 酸 盐 缓 冲 液(PBSA) □ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , 用 GIBCO 溶 液 A 配 制(参 见 2. 9 节) □ 乙 醇 7 0 % □ 75 cm2 培养瓶 □ l0 cm Petri 培养皿,塑料的,非组织培养级别 □带螺盖的离心管 , 15m l 和 50 ml □用于解剖的镊子和解剖刀(使用之前高压消毒并保存在 70% 酒 精 中 ) □可更换的解剖刀片, 1 1 号 非无菌 □计时妊娠鼠, 15.5〜16.5 天(经典常用的小鼠品系包括 SV 129 和C 57: BL) 步骤 (a) 处 死 妊 娠 15. 5〜16. 5 天的小鼠。 (b) 用 70 % 酒精擦洗鼠的腹面。 (c) 剪开皮肤和组织暴露子宫。 (d) 取出子宫角并放到含有 P B S A 的 10 cm Petri 塑料皿里。 (e) 用解剖刀从胚囊中取出胚胎,丢弃其他所有的组织包括胎盘以及胎膜。 (f) 取出含有脑组织的头的上部并丢弃。 (g) 沿着从头到尾的中轴从幼崽前端开始切开胚胎进行解剖,暴露及丢弃内部器官。 (h) 把胚胎剩余部分放在 50m l 离心管里用 P B SA 洗 4 遍 。 (i) 把胚胎剩余部分转人干净的 10 cm Petri 皿 中 ,去 掉 PBSA ,把胚胎用新的解剖刀切 成 2 mm 大小的小块。 (j) 把切碎的胚胎放到 15m l 离心管里,加 人 IOml 0 . 2 5 % 的胰蛋白酶,在 37°C 孵育 10〜20 min。 (K) 使小块沉淀下来,从孵育管中取出 5m l 胰蛋白酶以及分散的细胞,并且放到无 菌 的 50m l 的离心管里。 (l) 加人等体积的 M EFM 抑制胰蛋白酶活性。 (m) 再 加 人 5 ml 0. 2 5 % 胰蛋白酶到原先的含有胚胎的 15m l 离心管里,并 在 37°C再 孵 育 10’〜20 min (n) 重 复 步 骤(k) ,(I), (m ) ,大 约 进 行 5 次孵育,将所有加人的胰蛋白酶以及分散的细胞放人同一个 50m l 离心管。只有没溶解的软骨将被留在原先的含有胚胎的15m l 管中。 (O) 用力地分散胰蛋白酶消化的细胞悬液并允许剩余的小块沉淀。 (P) 取出并保存上清液,去除沉淀。 (q) 离心上清液, l000 g , 5 min (r) 用 IOml MEFM 重悬沉淀并用台盼蓝计数活细胞数 (s) 每 个 160 cm2 培养瓶接种 5 X IO6 细胞,再 加 人 IOml MEFM。 (t) 在 37°C 、5 % C02 温箱里孵育过夜。 (u) 第二天,用 20m l 的新鲜的 M EFM 培养基置换旧的培养基以去除细胞的碎片。 (V) 在冻存之前使细胞长到 8 0 % 〜9 0 % 汇合。 注意: 要 确 保 MEFs 细胞完全没有被任何微生物所污染,每次从小鼠胚胎新制备MEFs, 要在无抗生素的培养基中至少连续传]5 代 ,在这个时期如果没有观察到微生物污染,那么早期传代的细胞就可以扩增,并大量分装冻存起来,随后能够安全地用于日常 H ES 细胞的增殖。 2.3.2 M E F s 的继代培养 为了维持细胞库的供应以及避免出现先前讨论过的细胞衰老,关注 M E F s 的传代次数是关键,简而言之,应该以较低传代次数(p 〇〜p2 ) 的细胞用于维持细胞库,以较高传代次数(P3 和 p4 ) 的细胞用于制备无活性的可支持 h E S 细胞的询养层。 M EFs细胞在 4 代以后不能使用,这很重要,因为这个时期细胞已经衰老并可能很难扩增了。 M E R s 将在 75 cm2 或 225 cm2 的组织培养瓶中生长,这主要取决于需要多少飼养细胞(M E F s)s 在制备饲养层细胞板时,一个 75 cm2 培养瓶的 M E F s 如果灭活时达到80% 汇合,就可以为 2〜6 个 4 孔培养板提供细胞.s.—个 225 cm2 培养瓶的 M E F s 可用于大量储存细胞或者用来制备大量无活性的饲养层细胞板 a, 在进行 h E S 细胞培养工作 方 案 2.2 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞(M E F s) 的 传代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □0〜3 代的 M E F s 大约 80% 汇合, 75 Cm2 或 225 cm2 培养瓶 □ MEFM (见 2. 2. 3) □明 胶(高温高压灭菌, 0. 1% W /V □ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % ,溶 于 GffiCO 溶 液 A ( 见 2. 9 节) □ PBSA □台盼蓝活性染色 □ 离 心 管 , 15 ml □ 组 织 培 养 瓶 , 3 X 225 Cm2 □血细胞计数板 步骤 (a) 从 225 cm2 培养瓶中吸出培养基并用 IOml 的 P B SA 洗一次细胞。 (b) 力口 3m l 的胰蛋白酶并在 37°C 孵育细胞 4 min。 (c) 从孵箱里取出培养瓶并轻轻地敲击使 M E F s 进一步脱离培养瓶。 (d) 加 入 6m l 的 M EFM ,打散所有细胞确保没有粘连并防止成团。 (e) 将培养基和悬浮细胞转人 15m l 离心管中。 (h) 离 心 5m in, lOOOg。 (g) 把 5 ml 0. 1 % 明胶加人 3 个新的无菌的并将有 M E F s 传 人 的 225 cm2 的培养瓶中 ,室温下与凝胶最少孵育 5 min 。 (h) 从离心管中取出 M E F s 并吸出培养基,敲击管壁分散细胞沉淀,用 3m l 新鲜的 M EFM 重悬。用吸管吹散细胞以确保细胞是单细胞悬液,这对于传代培养瓶中细胞的均一生长是必要的。 (i) 从每个新的培养瓶中吸出 5 ml 0 . 1 % 明胶,加 入 25 ml M EFM 培养基。 (j) 把 3m l 的 M E Fs 分配 到 3 个 225 cm2 培养瓶中。 (k) 每 个 225 cm2 培养瓶中的细胞在下次传代时将继续分 3 份 。 来自前三代的 M E F s 细 胞(P0〜P3 ) 的每一代都能冻存起来维持细胞的储备或者被传代 为 h E S 细胞的增殖提供饲养细胞(见 2. 3. 5 节)。 4 代之后, M E F s 应该被丢弃因为这些细胞可能衰老或发生改变。 2.3.3 冻存小鼠胚胎饲养细胞 如 果 M EF 细胞要用于 hES 细胞的培养过程,那就必须维持大量的、高质量的、不同代(PO〜P4) 的 MEFS 冷冻贮存。传代次数早的细胞(p0〜p2 ) 应该作为细胞储备的种子细胞,它们可以继续传代,再次冻存以提供大量的更高代次的细胞(p3〜p4 ) 来 维 持 hES细胞的日常生长。一 个 7Scm2 培养瓶有 8 0 % 汇 合的 M EF 细胞将冻存产生一个冻存管的储 方 案 2.3 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 冻 存 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 含 有 M EFs 细胞的 75 cm2 培养瓶或 225 cm2 培养瓶, p0〜p4, 8 〇% 〜 90% 细胞汇合 □ M E F M (见 2. 2. 3 节) □ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , ED TA,溶 于 GIBCO 溶 液 A (见 2. 9 节) □ E S F B S □ D M SO □ P B S A □ 离 心管, 15 ml □冻存管 步骤 (a) 从 含 有 MEFs 细胞的培养瓶中去除培养基,并 用 P B S A 洗 一 遍 ,每 个 75 cm2培养瓶用 5 ml。 (b) 每 个 75 cm2 培养瓶中加入胰蛋白酶 lm l,确保整个培养瓶的单层细胞都能被覆盖 , 37℃孵育 4min。 (c) 轻轻地敲打培养瓶使细胞进一步脱落。加 入 5 ml M EFM 终止胰蛋白酶反应,吹 散 5〜6 次确保所有细胞没有粘连并防止成团。把 含 有 M E F s 的 培 养 基 转 人 15m l 离心管。 (d) 离心 5 min, IOOOg (e) 为冻存准备冻存管及写标签。标 签 内 容 应 该 包 括 M E F s 细胞新传代的代次,曰期和任何可能需要的信息。在无菌条件下将 lOOy DMSO 加人备好的冻存管里。 (f) 吸去上清,小心不要搅乱细胞沉淀。 (g ) 用 E S F B S 重悬细胞沉淀,每 个 75 cm2 培 养 瓶 900uI,用塑料吸管打散细胞,确认细胞沉淀已混勻。 (h) 把 含 有 M E F s 细 胞 的 E S F B S 转 移 到 装 有 DM SO 的冻存 管 里 ,立即储存到-80°C 冰箱过夜,储存之前要 彻底混匀。 (i) 第二天,把冻存管放到液氮里长期保存。 2.3.4 M E F s 细胞的复苏 从长期液氮保存中复苏 M E F 细胞,用于补充 M E F s 的储备或者用于灭活处理后支持未分化 hES 的 生 长 。 方 案 2. 4 复 苏 冻 存 的 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 一 支 M E F s 冻存管 □ MEFM (见 2. 2. 3 节) □ 明 胶 , 0. 1 % (高温髙压灭菌) □组织培养瓶, 75 cm2 □ 水 浴 箱 ,设置 在 37°C □ 吸 管 , Iml 步骤 (a) 在 75 cm2 培养瓶内加 3 ml 0 . 1 % 明胶,覆盖细胞将要黏附的表面,室温孵育至少 5 min (b) 从液氮罐中取出一支 M E Fs 冻存管。 (c) 在 37°C 水浴箱中快速解冻细胞。 (d) 把 0. 1 % 明胶从 7 5 cm2 培养瓶中吸出并加入 7m l 的 M EFM 培养基。 (e) 用 Im l 吸管把含有 M E Fs 细胞的 E S F B S / D M S O 混合液从冻存管里转移到含有M EFM 培养基的 75 cm2 培养瓶中。 (f) 在 37°C 孵育细胞过夜。 (g) 第二天早上用新鲜的 M EFM 培养基替换 7m l 培养基去除残留的 DM SO 和细胞碎片。 (h) M E F s 细胞生长达 5 天或细胞汇合达到 8 0 % ,每 2 天换一次液。 2.3.5 基于化学方法的 M E R s 细胞失活 MEFs (P0〜P4 ) 是一种快速分裂的细胞,因而在作为饲养细胞层使用之前需要抑制有丝分裂避免其过度生长。细胞分裂的抑制可通过放射和化学阻断方法获得,最普遍的是使用丝裂霉素 C ,它是一种为日常培养 h E S 细 胞 而 准 备 M E F s 细胞的简单、有效的方法。 安全提示:对丝裂霉素 C 进行操作时一定要当心,因为它有遣传毒性。始终要戴手套,并且只能在 I I 类 通 风 橱(小的生物安全柜)内操作。 h E S 细胞的增殖需要使 M E F 细胞失活,一 个 75 cm2 培养瓶大约 8 0 % 汇 合 的 MEFs细胞通常能提供 2 〜4 个(取 决 于 M E F s 细胞的产量)4 孔板 。方 案 2. 5 讨论了一75 cm2 培养瓶或一个 225 cm2 培 养 瓶 的 M E F s 细胞的失活处理,使 用 225 cm2 培养瓶需 方 案 2. 5 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞 的 生 长 抑 制 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 8 0 % 〜9 0 % 汇 合 的 M EFs 细胞, 75 cm2 培 养 瓶(或 225 cm2) □ MEFM (见 2. 2. 3 节) □ 胰 蛋 白 酶 , 0 . 2 5 % , 溶 解 于 GIBCO 溶 液 A (参见 2. 9 节) □ PBSA □ 明 胶 , 0. 1 % □ 丝 裂 霉 素 C (MMC), 50 ug /ml, 溶解 于 DMEM (过滤除菌) □多孔培养板, 4 孔 :通 常 每 75 cm2 培养瓶的 M E F s 细胞需 要 1 〜4 个培养板 □吸管 □ 离 心 管 , 15 ml 步骤 (a) 用 MEFM 以 1 : 10稀释 MMC,从 50 Mg/ml 稀释至 5 ug/ml。 (b) 在 4 孔培养板的每个孔中加人0.5m l 的明胶。 (c) 从 孵 育 箱 里 取 出 75 cm2 培 养 瓶 ,内 有 8 0 % 汇 合 生 长 的 p3 或 p4 代 的 MEFs细胞。 (d) 用 IOmI 的 5ug/ml:MMC,在 37°C 孵育 MEFs 细胞 2 h。 注意:因为制备的 M E F 细胞可能有变化,新的使用者将要确定 M M C 完全抑制细抱分裂的最佳浓度和孵育时间。 (e) 在 M M C 孵育的期间,把 0 . 1 % 明胶涂到 4 孔板,至少在使用前 5 min 涂板。 (f) 用 M M C 处理完之后,用 5m l 的 P B SA 洗细胞一次。 (g) 加 Im l 胰蛋白酶,于 37℃孵育 4 min。 (h) 轻轻地敲击培养瓶使所有的细胞脱落,并加人等体积的 M EFM 终止胰蛋白酶反应,转 移 到 15m l 的离心管。 (i) 在 含 有 M E F s 细 胞 的 15m l 离 心 管 里 加 人 M E FM 培 养 基 使 总 体 积 达 到 6 ml,IOOOg 离心 5 min。 (j ) 吸去上清,用 5m l 的 M EFM 重悬 M E F 细胞沉淀,仔细确认是单细胞悬液。 (k) 用血细胞计数板计数细胞。 (l) 从 4 孔板吸掉明胶。 (m) 每 个 孔 以 7. 5 X 104 个 接 种 M E F s 细胞 ,并 且 每 个 孔 中 M E F M 的总量达到500ul。 M E F s 细胞将在 6 h 内贴壁。 (H) 把新接种的培养板放到孵育箱里,准备第二天使用。 注意: M E F 细胞在失活之后死亡之前,能够 作 为 h E S 细胞的饲养细胞来使用的时间 为 7 天,理想的情况是把 h E S 细胞传到 M E F s 细胞失活 1〜3 天内的培养板上。
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方 案 2. 6 人 胚 胎 干 细 胞 系 的 建 立 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 5〜6 天的人胚泡,经 H F E A 允许,并且像先前讨论的完全经病人同意。 HFEA所要求的全部细节能够在 H E F A 的网站找到(http//:www.hfea.g0v.uk)。 □链霉蛋白酶, 0 . 5 % ,溶 于 DMEM □ 抗 人 抗 体 , 3 0 % 〜5 0 % □含有 Glutamax 的 DMEM □ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节) □豚鼠的补体,用 DMEM I : 1 稀释 □ 4 孔培养板的每个孔以 7.5X 104 的细胞数接种新的失活的 M EFs,含 有 500ulHES 培养基 □大孔吸管 步骤 (a) 使胚胎生长到胚泡阶段,通常大约 5 天。 (b) 如果胚胎没有从透明圈里孵出,用 5〜IOuI 的 0 . 5 % 链霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。 (c) 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育 i 〇 min,此抗体用含Glutamax 的 DMEM稀 释 3 0 % 〜5 0 % 。 (d) 在孵育之后,用 h E S 培养基短暂地冲洗胚泡使抗人抗体失活。 (e) 用 5〜IOmI 2 0 % 的豚鼠补体与胚泡在 37T:孵 育 5〜15 min, 目的是溶解胚胎滋养层,此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎将有助于溶解过程。 (f) 当胚胎滋养层完全溶解,用吸管轻轻地取出完整的内层细胞团并立即转移到含有 500ul h E S 培养基的 M E F s 培养板上。 (g) IC M 细 胞 2〜5 天内将贴壁,要每天观察细胞的生长。要在原位 停 留 1 5 天以上 ,如果需要,可以添加新的灭 活 的 MEFs (只有当集落大到足以传代时才能将它转到新 的 M E F s 培养板上)。 (h) 从 ICM 来源的细胞具有类干细胞的形态,通常出现在集落的中心。 (i) 当克隆达到约 0_1〜0.5 mm 大小时,用拉长的玻璃吸管将它们切割成 2〜10小块并转移到 2〜4 孔新的失活的 M E F s 培 养 板 中(见 方 案 2.7)。这个过程每 5〜7 天重复一次。 (j) 在新建立的 h E S 细胞系前几次传代之后, h E S 细胞的增殖就可按以下方案进行(见 2.5 节)。 注意: 一旦超过单一集落,初 建 的 h E S 细胞系的团块每一代都要冻存直到获得了大量冻存成功的冻存管(见 2 . 6 节)。 前 10〜1 5 代 最 少 5 0 % 的细胞将被冻存直到细胞系被很好的建立。
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方 案 2.7 h E S 细 胞 的 手 工 传 代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 新 鲜 的 M E F 板(最好是在失活处理后 1〜3 天内) □ h E S 培 养 基(见 2. 2. 1 节) □ 50 ul加样器枪头 □玻璃巴氏吸管 非无菌 □ 100M I 加样器,可调节的,调 至 50ul □火焰裸露的气体燃具或类似设备 □ 解 剖 用 倒 置 显 微 镜 ,最 好 有 一 个 可 设 定 37°C 的加热 台 ,放 在 I I 级层流罩中使用。 步骤 (a) 所有工作在无菌条件下进行,使用外科面具、手套,穿实验室外套。 (b ) 首先,用 500M1 h E S 培养基置换新鲜 M E F 培养板内的 M E F 培养基。 (c) 点燃煤气灯,用蓝色火焰烧玻璃吸管,轻轻旋转玻璃吸管,待柔软时拉长吸管产生比头发丝还要细的、密 封 的 狭 窄 末 端(图 2.1)。 (d ) 马上将所有拉好的吸管置于层流罩内保持无菌,吸管只能在传代时现拉,以减少污染的危险。 (e) 从温箱中取出 h E S 细胞培养皿放在加热的台子上。 (f) 根据它们的外观选择集落的未分化区域,未 分 化 的 h E S 细胞小而圆,紧密而透明。要避免选取棕色细胞区域(图 2.2),这个区域的细胞正处于自发分化状态。 (g) 用一个拉好的吸管的尖端,沿着未分化细胞区域切下,再切成较小的均等的块儿。典型的集落大小类似于图 2. 2 中所示,根 据 h E S 细胞系所特有的再生长率,可切 割 成 6〜10 块 。 (h ) 集落被切割后,用加样器安上合适的枪头吸取自由漂浮的小团块 (i) 将 集 細 』 转 移 至 新 的 M E F 血中,作为参考指南, —个新鲜 W M E F M可等量分配 4〜6 个较小的团块。 (j) 小心地将新旧 h E S 细胞培养皿放回温箱中,胞贴附,不要聚集在皿的中央。 (k) 第二天在新旧培养皿中再加入 250M h E S 培量换液吸去未贴附细胞的危险性。 注意:为了避免污染,每次伸入一个孔都要用新拉制的无菌的吸管 细胞反复暴露于酶,可能出现遗传改变,虽然必须注意这个问题,但这种方法适合于 h E S 细胞的大批量培养 方案 2 . 8 用肢原酶进行 h E S 细 胞 的 传 代 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 新 鲜 的 M E F 板(最好是在失活处理后 T〜3 天内) □ PBSA □ h E S 培养基 □ 溶 解 于 P B S A 的胶原酶 IV 溶 液(200 U /m l ) □细胞刮或拉长的玻璃吸管(见方案 2. 7) □机械加样器和吸头 □ 离 心 管 , 15 ml 步骤 (a) 吸 去 h E S 皿中的培养基,四孔板中的每一个孔用 500pd P B S A 洗两次。 (b) 每孔加人 500/xl 胶原酶 IV 溶液, 37°C 孵 育 8〜 lOmin。 (c) 用一个拉长的玻璃吸管轻轻地分离集落。 (d ) 用机械加样器将细胞转移至无菌的 15m l 离心管中。 (e) 用 750ul 新鲜的 h E S 培养基淋洗 h E S 培养板,将所有细胞集落收集到同一离心管中。 (f) 用加样器在 15m l 离心管中将集落打碎形成 I O 块或更多的小块。 (g ) 750 g离心 2m i n 。 (h ) 小心吸去上清,用 5m l 新 鲜 h E S 培养基重悬细胞。 i) 在 新 鲜 M E F 板的每个孔中,沿四周接种 4〜6 个团块。 ii) 将新接种的 h E S 细胞放入温箱中,贴附过夜,第二天加入新鲜的 h E S 培养基。
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方 案 2. 9 采 用 玻 璃 化 方 法 冻 存 h E S 细胞 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ hES-HEPES 培 养 基(见 2. 2. 2. 1 节) □ 1 0 % 玻 璃 化 溶 液(见 2. 2. 2. 4 节) □ 2 0 % 玻 璃 化 溶 液(见 2. 2. 2. 5 节) □ 多 孔 板 , 4 孔(图 2.3a) □开口拉长的玻璃化小管(图 2.3b ) □ 冷 冻 管 , 4. 5 ml □ 拉 长 的 玻 璃 吸 管(见方案 2.7, h E S 细胞的手工传代) □加样器枪头, 80M1 □ 配 有 大 孔 针 头(14 G) 的注射器 非无菌 □ 加 样 器 ,设 置 在 80W □倒置解剖显微镜,有一个可加热至 37°C 的台子,放 在 II 级层流罩中。 □装满液氮的粗颈真空液氮罐 □长臂的镊子 □取液氮用的适宜安全设备 步骤 (a) 准备一个玻璃化板(见 图 2.3a) 孔 I : h E S - H E P S E 培养基, Im I 孔 2 : 空白 孔 3: 1 0 % 玻璃化溶液, Iml 孔 4: 2 0 % 玻璃化溶液, Iml 朝上的盖子: IOfd 2 0 % 玻璃化溶液 (b ) 使用前将板置于温箱中 2m i n ,预 温 。 (C) 将 h E S 细胞系的名称、代 数 、时 间 以 及 其 他 相 关 信 息 预 先 写 在 4.5 ml 冷冻管上。 (d ) 将大孔注射器针头放在燃气灯上小心加热,用 它 在 4. 5m l 冷冻管的顶部和底部戳一个洞,使液氮可以在管内自由流动,这有助于保持细胞在保存过程中一直是冷冻状态。 (e) 将 h E S 集落切割成小块,大小约两倍于传代所需的团块。小的集落团块经不住融化步骤,因此在大批冻存前,要测定每个 h E S 细胞系团块的大小是否正确。 (f) 将 6〜8 块集落小块转移至孔 1 中, 60s 。 (g ) 用加样器将所有集落小块从孔 1 转 至 孔 3 , 精确计时 60s (h) 将集落小块从孔 3 转至 孔 4 , 精 确 计 时 30s。一定要精确计时,因为在非冷冻状 态 下 D M S O 溶液对细胞有毒性。 (i) 将集落小块转移至 I O p d 小滴中。 (j) 用一个加样器,在吸头的末端安上玻璃化小管(见 图 2.3b ) , 小心但迅速地将含有集落小块的溶液吸入。 (k ) 小心移去吸头,用一对长臂镊子将小管稍微倾斜浸人液氮,使细胞瞬间冷冻。 (l) 一 旦 冻 住(约 5〜10s) ,就将小管放入 4.5m l 冷冻管,再放回液氮中。 (m ) 当液氮充满冷冻管时,将存有小 管 的 4.5m l 冷冻管放入长期保存的液氮储存器中 ,用于日后复苏。 2.6.2 解冻 hE S 细胞 h E S 细胞的解冻速率具有很大可变性,因 此 最 好 是 「经验操作」,确定冻存集落的最适大小,获得解冻之后的最大的再生长。 方 案 2. 10 解 冻 玻 璃 化 冻 存 的 h E S 细胞 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ —小管冷冻的 h E S 细胞集落小块,最好放在一个可移动的液氮容器内。 □ M E F 板(最好在用前失活处理 1〜3 天) □ h E S - H E P E S 培 养 基(见 2. 2. 2. 1 节) □ 蔗 糖 溶 液 , 0. I m o l / L (见 2. 2, 2. 3 节) □ 蔗 糖 溶 液 , 0. 2m o l / L (见 2. 2. 2. 2 节 □ 多 孔 板 , 4 孔(图 2. 3a) □ 80ul 加样器枪头 非无菌 □ 加 样 器 ,设 置 在 80ul □倒置解剖显微镜,有一个可加热至 37°C 的台子,放 在 II级层流罩中。 □装满液氮的隔热容器 □长臂镊子 □取液氮用的适宜安全设备 步駿 (a) 如 图 2. 3 所示准备及预温解冻板: 孔 2 ,蔗糖, 0.lmolL ………………………….. Im I 7L 3 和孔 4, hES - HEPS培养基 ………….. …….1ml/孔 (b) 从长期液氮储存器中取一个冷冻管放入 一 个便携式液氮容器中。 (c) 用镊子取一个 h E S 细胞的小管,放入层流罩中。 (d) 快速操作,用手指压住小管的上端,将狭小的末端浸人含有0.2m 1/L 蔗糖的孔 1 中。 (e) 只要冻存物一融化,就要立 即 取 出 h E S 细 胞 团 块 放 至 蔗 糖 溶 液 中(用加样器排出所有剩余溶液)。 (f) 精确 孵 育 60s ,而后转入孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖)中。 (g ) 在 孔 2 (0. l m o l/L 蔗糖)中孵育 60s。 (h ) 将细胞转移至孔 3 (h E S -H E P E S ), 5m i n 。 (i) 解冻的最后一个步骤,将细胞转移至孔 4, 5m i n 。 (j) 经过最后一个步骤之后,用加样器收集 h E S 细胞接种于 M E F s , 如 前 所 述(见方 案 2. 7)。
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实验步骤 |
方 案 2. 11 通 过 焚 光 免 疫 细 胞 化 学 分 析 h E S 细 胞 的 特 性 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 0.1 % 明胶包被的玻璃盖玻片上的h E S 细胞 非无菌 □ 4 % 多聚甲醛 □ P B S A □ T ris-缓 冲 盐 溶 液(T B S 一) □含有 0.5 % T r i t o n X -100 的 Tris-缓 冲 盐 溶 液(T B S + ) □ 奶 粉 , 5 % W /V ,去 离 子 水(d H 20 ) 配制 □ 一抗; S S E A -1、 -3、 -4、 T R A -1-60、 -1-81 及 0 C T -4 □适宜的二抗 □ 封 片 剂 ,如 Fluorosave □吸气器和吸液管 □铝箔 □纸板染色盘 □ 可 置 于 2 4 孔板的玻璃盖玻片 □ 平 板 摇 床(可选择) □荧光显微镜和相机 步骤 第 1 天 (a) h E S 细胞可生长于M E F 伺养层细胞上一起染,因 为 M E F s 不会表达 任 何 hES细胞的标志物。一个24孔板要接种5 X IO5 个经丝裂霉素 C 灭 活 的 M E F s ,种 在 0.1 %明胶包被的13m m 玻璃盖玻片上,如 前 所 述(方 案 2. 5)。 (b ) 在固定之前, h E S 细胞最好要 传 代 至 有 M E F 细 胞 的 盖 玻 片 上 生 长 2〜3 天 ,以使细胞贴附并生长成单层,每一种抗体至少要用两孔h E S 细胞进行染色。 (c) 从生长着 h E S 细胞的盖玻片上吸去h E S 培养基,用 500W P B S A 洗一次。 (d ) 用 4 % 的多聚甲醒固定30 —— 4 0 m i n 。 (e) 吸去固定液,用 5 0 0 4 P B S A 洗一次。 (f) 每孔加 人 500f i l T B S + , 室 温 孵 育 15m i n , 最好放在平板摇床上摇,吸液时要小心 ,不要碰掉细胞。 (g ) 吸去 T B S + , 重 复 步 骤(f) 4〜5 遍 ,以保证细胞被彻底清洗。 T B S + 也使细胞渗透性增加,使抗体染色更充分。 (h ) 清洗结束时,用 500ul 溶 解 于 去 离 子 水 的 5 % 奶 粉 溶 液 孵 育 细 胞 30〜60m i n ,以阻断非特异性的抗体结合。 (i) 在此孵育过程中,根据供应商的提示,用 5 % 奶粉溶液稀释好一抗。 (j) 吸去奶粉溶液,重 复 洗 的 步 骤(f) 4〜5 次 ,已保证除去所有非特异性结合的抗体。 (k ) 每 孔 用 250〜500M 1相应的一抗 5 % 奶粉溶液孵育,室温过夜。最好放在平板摇床上摇,或者要确认细胞已被浸没。 注意:加液和吸液时要小心谨慎,以避免抗体的交叉污染。 第 2 天 (a) 吸去一抗溶液,每一种抗体用不同的吸头以避免交叉污染。 (b ) 用 T B S — 洗细胞,每 孔 500m 1。 (c) 用 T B S 醉育细胞,每 孔 500jlJ , 15m i n ,放在平板摇床上。 (d) 吸 去 T B S ‘ ,重 复 步 骤(c) 4〜5 遍 ,以保证除去一抗。 (e) 在清洗孵育过程中,可 用 TBS+ 配制相应 的 二 抗 ,每 孔 需 要 250〜 500ul抗体一T B S 1溶液 ,根据是否使用平板摇床来决定加的量(250ul 或 500ul)。 注意:如果使用 D N A 荧光染色显示核,要在这时阅读步驟(g )。 (f) 清洗结束时,吸 去 T B S - 溶 液 ,每 孔 加 250〜500ul抗体-T B S + 溶液孵育细胞,放在平板摇床上,室温孵育至少 l h 。 (g ) Hoechst 33258或 D A P I 可用于显示 h E S 细胞的核,可能要以适宜的浓度加人到二抗溶液中,可与二抗溶液一起孵育。 (h ) 用相应的封片剂封片,如 Fluorosave。 (i) 用荧光显微镜和照相设备观察之前,要让片子彻底干燥。 注意:所有 的 二 抗 以 及 用 二 抗 孵育的板都要用铝箔包 起 来 , 以 防 被 日 光 漂 白 。 方 案 2. 12 R T -P C R 合 成 h E S 细 胞 的 c D N A 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 几 小 块 h E S 细胞集落,按照与常规传代相同的方法制备(见 2. 5. 1. 2 节 非无菌 □ R N A 提取试剂盒,如 R N A e a s y D 5 X A M V - R T Superscript e n z y m e □ 缓 冲 液 :含 10m m o l / L M g C l 2 的 A M V - R T □ 引 物 : oligo (d T )I8, 2ug/ul □ 引 物 : oligjj C d N >i。, 2ug/ul □ 核 苷 : d N T P s , 2m m o l / l □核糖核酸酶抑制剂 : R N a s i n □ 模 板 :提 取 的 R N A , 2ug □ 无 R N A 酶的水 □ 设 置 在 70°C 的加热块 □ P C R 热循环仪 □加样器和吸头 □冰 步藤 (a) 使 用 R N A 提取试剂盒,按照制造商的说明书从 h E S 细胞制备 R N A 模板 (b ) 准 备 R T -P C R 的预混液: d N T P s , 2m m o l / L 1ul 方 案 2. 13 通 过 P C R 分 析 h E S 细 胞 的 基 因 表 达 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 几 小 块 h E S 细胞集落,按照与常规传代相同的方法制备(见 2. 5. 1.2 节)。 非无菌 □10XTaq 缓冲液(标准液是 25 mmol/L MgCl2) □ T a g D N A 多聚酶 □ d N T P s , 2m m o l / L □ R T -P C R 合 成 的 c D N A 模板 □ 高 压 消 毒 的 d H 20 □琼脂粉 □溴化乙啶 □ 5 X 上样染料 i v ) 将一个梳子放人 P C R 胶的模具中,将热的混合物轻缓地灌人。注意不要产生气泡,因为气泡会妨碍 D N A 在胶中的迁移。 V) 拔 梳 前 置 室 温 30m i n , 使胶冷却直至凝同,放在电泳 槽 中 ,以 50m m o l / L溴化乙啶缓冲液覆盖之。 (d ) P C R 循环完成后,将样品从循环仪中取出。 (e) 每个样品中加 5M 1 上样染料,将样品加至胶中,确认同时加了 肌动蛋白阳性对照样品以及 D N A 梯形标准品。 (f) 开始电泳, 100V , 30〜40m m , 直 到 D N A 梯形标准品已经清楚地分开,在紫外灯下很容易区分。 (g ) 用 一 个 U V -透 视 器(波 长 315n m ) 看 胶 ,如果需要,用相机拍照。 (h ) 将每一个样品的所有 D N A 片 段 与 D N A 梯形标准品相比较,观察是否有预期的 带(前已述及),(3-肌动蛋白阳性对照样品也要被证实已经显示。 (i) 预期大小的 D N A 条带可以用洗胶试剂盒(如 G E N E C L E A N ® ) 很容易提取出来 ,并且应该通过测序来证实。
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方 案 2. 14 由 h E S 细 胞 产 生 胚 胎 样 小 体 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F s 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 加样器,设置在 50ul □ 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿(特 殊 包 被 过 的 皿 ,可 防 止 细 胞 附 着 ;见 2.9节) , 2. 6 cm。 □拉长的玻璃吸管(见方案 2.7) 非无菌 □ 带 有 37°C 加热台的解剖显微镜 步骤 (a) 在 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿 中 加 人 2〜3 ml h E S 培 养 基 。 (b) 从温箱中取出未分化的 h E S 细胞,放在解剖显微镜的加热的台子上。 (C) 用拉长的玻璃吸管(见方案 2. 7) 将集落切成小块,块的大小大约与hES细胞手工传代切的大小(300〜500 个细胞)相同,要小心解剖,只取未分化的细胞。 (d) 当集落的所有合适的区域都被分离,得到足够的细胞小块时,收集所有漂浮的小块转移至低附着力的培养皿中,细胞团块而后将形成自由漂浮的细胞球体—- 胚胎小体(Ebs) (图 2. 4)。 (e) 第二天早上检查一下这些 Ebs, 确认它们没有贴附在皿底,如果贴附了,可以用拉长的玻璃吸管小心地使它们移动,可以自由漂浮。 (f) 在 标 准 h E S 培养基中孵育这些 Ebs 3〜5 天,每天补充 lm l 培养基
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