一、cDNA阵列CGH
(1)阵列制备
与变性探针杂交前,先用封闭液(盖上盖片)在37℃封闭cDNA阵列1h
(2)随机引物标记基因组DNA
1.肿瘤和正常组织基因组DNA各2μg分别用Dnp II消化1〜1.5h。将消化产物进行纯化(QiaquickPCR试剂盒)、真空干燥,用25μL水重悬。
2.使用Bioprime标记试剂盒基本按说明书进行随机引物标记,稍作改动。100℃变性DNA和20斗随机引物(试剂盒中含有)5min,迅速放于冰上冷却,并加人2.5μL dNTP、1.25μL dCTP、IμL Cy3/Cy5-dCTP、IμL Klenow片段(试剂盒中含有),37℃孵育90min。
3.混合Cy3和Cy5标记产物,上样到Micrcon30滤器。2000g离心10min,检查样品容器确定标记产物的存在(紫色)。直接加入30μL Cot-1DNA、100μg酵母tRNA、20μg poly(dA-dT),5000g离心20min。为了重新收集样品,加入15ml杂交缓冲液,将Micrcon30滤器倒置放入新的收集管,16000g离心1min。
(3)探针变性和杂交
1.在加热的水浴锅或PCR仪上100℃变性探针90s,冰上冷却探针后,在37℃复性0.5〜1h。
2.将探针加到微阵列上,盖上玻璃盖片并用橡皮泥封片。在65℃用杂交缓冲液湿润的湿盒中杂交16〜20h。
(4)洗脱
1.将cDNA微阵列于2×SSC、0.03%SDS中65℃洗5min,接着用1×SSC、0.2×SSC室温下各洗脱5min。
2.低速(50g)离心5min使标本片干燥。
二、阵列CGH
(1)阵列制备
1.基因组克隆(BAC、PAC、黏粒等)在相应抗生素存在的条件下生长,并用商业化试剂盒大量提取基因组DNA,—般得到10μg数量级的产物。用酚/氯仿的标准化程序进一步纯化DNA。
2.DNA大小和质量在1%琼脂糖凝胶电泳上评估,用UV光度计定量DNA。
3.靶DNA经超声波破碎得到1.5〜15kb片段,沉淀、重悬至适宜浓度,用毛细管以200〜400μm直径点样到玻璃载片上。
4.向阵列上加上20μL封闭液,盖上盖片,37℃湿盒复性1h。
(2)用缺口平移法标记基因组DNA制备探针
1.肿瘤和正常组织基因组DNA各2μg分别用缺口平移法进行标记,反应混合物如下:
A) Cy3反应物(加水至总体积100μL
(1)肿瘤基因组DNA:2μg。
(2)10×Cy3dNTP:10μL。
(3)DNA聚合酶1μL。
(4)DNaseI。
B) Cy5反应物(加水至总体积100uL):
(1)正常人基因组DNA:2μg。
(2)10×Cy5dNTP:10μL。
(3)DNA聚合酶1μL。
(4)DNaseI。
2.16℃标记反应1.5h后,将标记反应混合物放于冰上。
3.标记产物的大小在1%琼脂糖凝胶电泳进行评估,进行CGH实验的理想片段长度在500〜2000bp范围内。如片段过长,在反应混合物中加入适量的DNA聚合酶I和DNaseI,在16℃继续反应。
4.向标记反应混合物中加入0.1倍体积的0.3mol/LEDTA终止反应。
5.用Sephade×G50离心柱除去标记混合物中未掺入的核苷酸。
6.混合两种标记探针,加人50μL Cot-1DNA、0.1倍体积的3mol/L乙酸钠、2倍体积的冰冷100%乙醇沉淀探针。用70%乙醇洗涤沉淀、晾干,然后用20uL杂交缓冲液重悬探针。
(3)探针变性和杂交
1.75℃变性探针5min,然后在37℃复性0.5〜1h以充分封闭重复片段。
2.将探针加到完成预复性的阵列上,盖上盖片并橡皮泥封片,在37℃用杂交缓冲液湿润的湿盒中杂交24h。
(4)洗脱
1.阵列在55℃50%甲酰胺/2×SSC,pH7.0中洗3次,每次10min,然后在含0.1%NP-40,pH8的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中室温洗5〜10min。
2.去掉多余的液体,加DAPI/抗淬灭剂后盖上盖玻片。
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