基 本 方 案 直 标 法 检 测 小 鼠 巨 噬 细 胞 的 表 型
材料
小鼠IgG, Caltag) 荧光素标记的单克隆抗体(M A b ,表 6. 2.1和 表 6. 2. 2) 表 6 . 2 . 1 小鼠
巨噬细胞表型鉴定用单克隆抗体 杂交瘤 命名 检测细胞 ATCC 参考文献 30-H12 THY-I T 细胞 TIB107 Lanier et al. , 1981 巨噬细胞前体 Ledbetter and Herzenberg, 1979 MI/70 MAC-I 粒细胞 TIB128 Ho and Springer, 1982 巨噬细胞 Ralph eia/. , 1983; Springer, 1981 F4/80 — 巨噬细胞 HB198 Walker, 1987 嗜酸性粒细胞 Walker, 1989 McGarry and Stewart, 1991 HK1. 4a LY6c 粒细胞前体 — McCormack a/. , 1991 髓单核细胞 Havran ejtaZ. > 1988 a. HK1. 4 由美国芝加哥大学病理系W. L. Havrari博 士 和F. W. Fitch博士提供。 表 6 . 2 . 2 检测管和对照管中所加试剂a 试管编号 1 2 3b 4C F4/80-TC F4/80-PE — EMA 30-H12-PE MAC-I-FITC — — Ly6 c-Biotin Ly6 c-Biotin — — a .缩 写 : TC, Tandem Conjugate (PE-Cy5); PE,藻红蛋白; FITC,异硫氰酸荧光黄; F4/80-TC 和 30-H12- PE 购自 Caltag 公 司 ; MAC-I-FITC 购自 Biosource International 公 司 ; F4/80-PE 和 Ly6c-Biotin 购自 Caltag 公司。 b. 3 号 管 (不加抗体),自发荧光对照管。 c. 4 号 管 (加 EMA,不加抗体),细胞活力对照管。 F I T C 标记的链亲和素和T C 标 记 的 链 亲 和 素 (Caltag) n/ E M A (ethidium monoazide) 溶液 V A C K 裂 解 液 (新鲜配制,室温保存应< 1 2 h) ,推荐使用 V P B S 7 2 % (m /V ) 甲醛 12m m X 75m m 试管 低 功 率 白 炽 灯 (如 40W 白炽灯)" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469600378647sqjwxur64qpng_small.jpg" style="width: 522px; height: 607px;" />
Sorvall RT 6000B 离心机
I . 准 备 4 只 12m m X 75m m 试管,将试管编号为 1〜4。每 管 中 加 入 2 X IO7个细胞/ml细胞悬液 50ul。
2.每管加入 3 mg/ml 阻断 I g G 4ul, 4°C 孵育 lOmin。
3 . 按 表 6. 2. 2 所示 ,在 1 号 和 2 号管中加入适量的生物素偶联的单抗,然 后 将 1 号 、 2号 和 3 号试管冰浴 15 min。
4 . 在 4 号管中加人 5M1 E M A ,混匀。将 试 管 置 白 炽 灯(如 40W 白炽灯)18c m 远 处 ,室 温 lOmin。E M A 只 能 进 入 死 细 胞 。 利 用 死 细 胞 的 强 染 色 性 , 在 F L l 和 F L 3 双 变 量 散 点 图上 可 与 活 细 胞 相 区 分 。
5 . 每管加入 3m lPBS, 1500 g 离 心 3 min。 迅速倒掉上清,试管直立后,手指轻弹管底,使细胞沉淀变松。在 1 号管中加入 F IT C 标记的链亲和素; 2 号管中则加入 T C 标记的链亲和素。然后将 4 只试管冰浴 lOmin, 其 中 3 号管和 4 号管的细胞弹松即可,不需补加液体。
6 . 样 品 含 红 细 胞 时(如新鲜分离的骨髓细胞或脾细胞),每管需加入 3 m l A C K 裂解液;不含红细胞的样品,每管加入 3m l P B S 。
7 . 盖紧试管盖,颠倒试管 1〜2 次 ,混匀细胞后,室温静置 3 min。
8 . 室温, 1500&离 心 4 min,迅速倒掉上清,试管直立后,轻弹管底使细胞沉淀变松。
9 . 加 入 3 ml PBS 洗涤细胞,方法参见步骤 7 和 8 。
10a 直接检测时:加入 20()/^?83,混匀细胞, 4 ℃ 避 光 待 检(可保存<4h)。
IOb 固定后检测时:每管加人 IOOpJ 2 % 甲醛,混匀,加盖, 4°C 避光,固定 Ih 后待检。甲 醛 会 改 变 细 胞 的 光 散 射 值 。
II. 用流式细胞仪进行检测,然 后 用 F A C S c a n 分 析 结 果(第四章)
备 选 方 案 间 标 法 检 测 小 鼠 巨 噬 细 胞 的 表 型
附 加 材 料
4 . 每管加入 4ul 浓 度 为 3m g /m l 的正常小鼠血清 IgG。冰 浴 lOmin,以阻断二抗上非特异结合位点。
5 . 每管加入适量荧光素标记的抗 F (ab)[片段二抗。混 匀 ,冰 浴 15 min。
6 . 按基本方案步骤 9 洗涤细胞。
7 . 可选操作:细胞不经洗涤,直接在待测管和 A 管中加入适量的第二种荧光素标记的二抗。 B 管中加入等量的荧光素标记的小鼠 IgG, 用以检测步骤 6 的阻断效果。
8 . 余 下 步 骤参见基本方案步骤 9〜11