基本方案 3 SDS-P A G E 后原位检测 J N K 蛋白激酶活性 [「胶内」(IN-G E L )
激酶测定] 该方案改良自 Gotoh 等 1 9 9 0 年报道的方法。由 于 J N K 对 GST-cJmi ( 1 - 7 9 ) 具有 高特异性,所以该方案最适合测定 J N K 活 性 。如 果 在 胶 中 加 入 GST-Elkl (310-428) 或 M B P ,该方案也适用于检测 E R K 的活性,但 此 时 也 能 检 测 出 其 他 能 催 化 Elkl 或 M B P 的激酶,在分析结果时应特别注意。
材 料
基本方案 4 利用磷酸化位点特异性抗体检测 M A P K 的活化
用 Biosource、 Cell Signaling Technology 及 Promega 公司的抗体均可进行如下所述 的检测,本方案将以 Cell Signaling Technology 的磷酸化-S A P K / J N K (Thr-183/Tyr- 1 8 5 ) 抗体为例。这一方法检测的是 M A P K 的活化作用,因此并非直接测定 M A P K 的 活性。
材 料
辅 助 方 案 制 备 GST-M A P K 底物融合蛋白
GST-Elkl (310-428) 用作 E R K 的 底 物 、 GST-cJim (1-79) 用作 J N K 的底物、 G S T -A T F 2 (1-109) 用作 p38 的底物。
材 料
感受态的 (B L 21; Novagen) 编码 G ST -M A P K 底物融合蛋白的质粒 DNA (来 自 Roger.Davis@ Umassmed.edu 或 Alan.J.Whitmarsh @ man.ac.uk, 或 类 似 质 粒), 或纯化的 cjun 和 ATF