实验步骤 |
透 射 电 镜 样 品 制 备 技 术 为了满足透射电镜观察的要求,超薄切片必须做到以下几点:①切片能够耐受电子 束 的照射,在热和高真空条件下有一定的稳定性。②细胞的超微结构保存良好,尽量减少人工假象。③ 切 片 厚 度 一 般 在 60〜80nm 为 宜 。切片太薄可得到较高的分辨率,但 反 差 弱 ;切片太厚,又会出现结构重叠,分 辨 率 低 ,甚至会出现电子束不能穿透切片以致无法观察的现象。④要求切片无皱褶、无 刀 痕 、无颤痕和无染色剂污染,并具 它将成为细胞结构的支架,并能承受切片时的各种力的作用。 包埋剂:环氧树脂包埋剂常温下为单体,属于甘油多聚酯类,分子中含环氧基和羟基两种反应基团,环氧基与胺类 (加速剂) 反应,形成首尾相接的长链状聚合物,而硬化剂 (固化剂) 的酸酐则与羟基结合形成分子间的横桥连接◦ 环氧树脂单体、胺类和酸酐等按一定比例混合,在一定温度条件下,可形成具有三维空间结构的稳定交联状聚合物。常用包埋剂的配制:环氧树脂 Epon812 是一种淡黄色、低黏度,使用最广泛的环氧树脂,它易渗入组织,利于细胞结构的保存。它与硬化剂 D D S A (十二烷基琥珀酸酐)、 M N A (甲基内次甲基邻苯二甲酸酐) 和加 速 剂 DMP-30[2, 4, 6-三 (二甲氨基甲基) 苯酔] 按一定的比例配制而成,见 表 2.4。 (3) 包埋和聚合方法:将胶囊注满包埋液,用牙签移动样品到胶囊的中心,使组织自然沉落到胶囊的底部。如做定向包埋 (如皮肤、消化道、呼吸道等组织),取材时应将组织切成长方形,包埋时将所要切片的一端对准包埋模具的尖部进行包埋。包埋后样品放入聚合器内,聚合温度及时间为: 35℃ , 12 h ; 4 5℃ , 12 h ; 60℃, 24 h 。 半 薄 切 片为了在电镜下最后确定感兴趣的组织的位置,』获得在光镜下检查的半薄组织切片是很有必要的。 修块 将包埋块修成与顶面呈 45。斜面的锥体形。顶端是切片面,修成梯形、正方形或长方形。 切半薄切片 用 超 薄 切 片 机 切 下 的 切 片 ,滴一滴蒸馏水在涂有血清的载物片上,将切片浮在蒸馏水滴上,在 70——80 ℃电热板上烤干后,再进行苏木素-伊红 (HE) 染色。 超 薄 切 片载网及支持膜 (1) 载 网 :超薄切片需放置到铜、镍 、金等材料制成的载网上,经染色后才能在电镜下观 察 。 载 网 的 直 径 为 3m m ,孔 数 有 50、 100、 2 0 0 和 4 0 0 目。最 常 用 的 是 200目载网。 (2) 支持膜:在载网上铺覆一层薄膜是为了增加切片对电子轰击的耐受强度。 支持膜的制备方法:支 持 膜 是 用 0.4% 火棉胶-醋酸戊脂溶液或 0.1%〜 0.2% 聚乙烯醇缩甲醛膜 (formvar 膜) 氯仿溶液制备而成。先将干净载玻片浸人上述液体中,提出载玻片并使之直立于滤纸上,待干后即在载玻片上形成一层薄膜。用小刀或镊子尖划断膜的四边 ,将载玻片插入双蒸水中,使薄膜与载玻片剥离而漂浮于水面上。再将洗干净的铜网凸面贴膜,排列于膜上。最后用干净载玻片捞起支持膜及铜网,干燥备用。 超薄切片 (1) 超薄切片机:现市场上有国产及进口的不同牌号的切片机,就其推进原理可分为热膨胀式和机械式两种类型。不同型号的超薄切片机操作方法不同,使用者应按仪器操作手册进行操作。 (2) 切 片 刀 :切片刀分有玻璃刀和钻石刀两种。大多数是使用一次性的玻璃刀。钻石刀价格昂贵,适合用于硬度高的样品。 (3) 超薄切片厚度: 60——70n m 。 (4) 捞 片 :用眉毛针把切片集中,然后用铂金丝圈将它捞出,放置于载网中央。 超 薄 切 片 的 染 色指染色剂 (一般为重金属盐) 与细胞的某些成分结合或吸附,从而增加其散射电子的能力。不同部位对重金属盐离子的吸附能力不同,吸附重金属能力强的区域,散射电子的能力就强,表现为暗区,反之为亮区。 醋酸双氧铀-柠椽酸铅染色法 (1) 醋酸铀:又称醋酸双氧铀。能与细胞内大多数成分结合,主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差,也能对糖原、分泌颗粒和溶酶体染色,但对膜结构染色效果差。 醋酸铀染液:使用棕色试剂瓶配制染液,醋酸双氧铀 2 g 加 5 0 % 乙 醇 IOOml,充分搅拌 lOmin,静 置 1〜 2 天后取其上清液或过滤后取其过滤液。醋酸铀具有一定的放射性及化学毒性,遇光易分解,应密封避光冷保存。 (2) 柠檬酸铅:铅的电子密度很高,对细胞的微细结构有广泛的亲和力,能提高细胞膜系统、脂类和糖原颗粒的反差。柠檬酸铅具有一定的毒性。 柠檬酸铅染色液: 将上述成分放入 50m l 容量瓶中,用力振荡 30 min,至溶液呈乳白色混浊状后,加入lmol/L N a O H 8m l ,使溶液变为清亮透明,再加 双 蒸 水 至 50m l ,染 液 p i m . O , 置 4 ℃ 冰箱保存。 2 ) 娃胶板染色法 硅胶板染色器具:小玻璃试管 2 支 ,同时每根试管各配一个橡皮塞子;硅 橡 胶 板 1 块 :用双面刀片在板上划两排共 36 条划缝 (图 2.1)。 染色方法: (2) 将硅橡胶板插入试管内,加入铀染色液 ,盖好橡皮塞子,染 色 15——20 min。 (3) 用镊子将硅橡胶板从试管内取出,用蒸馏水冲洗 20 min,再用滤纸将水吸干。 4) 用同样的方法将硅橡胶板插入到另一根试管内,加 入 铅 染 液 ,盖好橡皮塞子,染 色 5——7m in , 取 出 板 用 蒸 馏 水 冲 洗 20m in , 用滤纸将水吸干, 自然干燥后即可电镜观察。 注意:①铅染液最好使用 99.99% 的高纯度的硝酸铅配制,因为其染色效果好并且不易污染切片。②由于醋酸铀和柠檬酸铅染液具有放射性和毒性,因此操作时要注意防护。 特 殊 样 品 的 制 备1 ) 血细胞、骨髓细胞 抽静脉血 (抽骨髓)3——4m l ,放入含有肝素抗凝剂的离心管内摇勻,以 800——1000r/min的 速 度 离 心 8〜 lOmin,血液可分为血浆 (上层)、白细胞 (白色中层) 和红细胞 (红色下层) 三层 。用吸管沿管壁轻轻地将血浆吸掉,露出白细胞层,沿壁缓慢加人 2.5% 的戊二酵,4℃固 定 lh。取出透明层,切 成 l m m x l m m x 2m m 长方块,再用戊二醛固定 1h。其他步骤按常规样品制备。 2 ) 培养细胞样品 由于培养细胞小、数量少以及培养方式的多样化,使得完全按照同一个方法制备样品已不能满足培养细胞电镜观察的要求。应根据观察目的选择合适的细胞培养方式,再采用不同的制样方法。 (1) 根据观察目的的不同,归纳了 4 种不同的细胞培养方式:①观察细胞一般形态的超微结构,细胞应在培养瓶 (玻璃或塑料) 或培养皿 (玻璃或塑料) 内培养,细胞呈贴壁式或悬浮式生长;②观察细胞和细胞间的连接结构,细胞应在载玻片、可拆卸的 9 6 孔培养板中或滤膜 (millipore 0.45p m pore) 上培养;③观察原位特定细胞 (如观察某个培养细胞的 (2) 根据不同的细胞培养方式,选择不同的样品制备方法。 a. 培养瓶内细胞的样品制备方法:游离的培养细胞以 800〜 100 〇 r/m i n 的转速离心IOmin,细胞沉在离心管底部,1.5 h 。其他步骤按常规制样方法进行。贴 壁 细 胞 :用硅胶刮将细胞刮下来,切忌使用刀片刮,离心后按上述方法制备。 b . 原位包埋法:①细胞长在载玻片上:将细胞连同载玻片一起固定、脱水和浸透 。细胞面朝上与液体直接接触。在光镜下先选好要观察的细胞区域然后再包 埋 。②细胞在可拆卸的用吸管吸去培养液,加人戊二醛固定液 4 ^ 固定 96 孔板内培养:样品制备在板内进行,固定、脱水、浸透和包埋均按上述方法
|
---|
实验步骤 |
扫 描 电 镜 样 品 制 备 方 法取材取材的要求基本与透射电镜相同,但观察样品面积可大些 [(l-l.5) mm x (3〜5)mm 。 清洗组织表面如覆盖有黏液、分泌物 (如 气管、肠等) 或有一些杂物 (如胃表面除有分泌物外还有未消化的食物等) 的样品,需经过充分清洗后方可固定,否则将会影响电镜观 察 。 清洗方法:对表面覆盖有杂物的组织,可以先用生理盐水或 P B S 将杂物冲洗掉,再用蒸馏水漂洗两次。对表面有蛋白黏液分泌物的样品,可先用蛋白水解酶作用使之变成易溶于水的颗粒,再用蒸馏水漂洗。 固 定 、脱水与透射电镜样品制备基本相同。 注 意 :为 了 减 少 细 胞 表 面 结 构 的 收 缩 ,脱 水 应 从 低 浓 度 的 3 0 % 乙 醇 开 始 ,经50%-70%—8 0 % —85%—9 0 % —9 5 % 乙醇,最 后 到 1 0 0 % 乙醇递增脱水。除 1 0 0 % 乙醇 样 品 的 干 燥样品的干燥处理是扫描电镜制样技术的关键,干燥方法有真空干燥法、冷冻干燥法、临界点干燥法和化学干燥法。以前临界点干燥法应用最多,其操作简单,干燥效果也较好 ,但需要专门的仪器。近几年化学干燥方法应用更为广泛。 1 ) 临界点干燥法 操作步骤:样品脱水后经醋酸异戊酯置换,放 入 C O 2 干燥仪样品室,注入液体 C O 2至样品室 7 0 % 的容量并加温至 35T ,此时压力达到 110 个大气压, C O 2 气液界面消失,维持一定时间后放出 C O 2 气体。 2 ) 化学干燥方法 使 用有机溶剂六甲基二硅胺焼 (hexamethyldisilazane, H M D S ),使有机物质中的非活性氢发生酸化反应,提高有机物质的挥发性、溶解性和反应性,迅速除去样品中的水分和前期处理过程中存留于组织中的有机溶剂而使样品 干燥。该法不需要任何仪器设备,没有中间环节对样品的影响,具有操作简单、费用低、用时少和干燥效果好的优点。 样 品制备方法:样 品 经 100% 乙醇脱水后,进 入 到 H M D S (I) 和 (II)15 min/次 ,最后样品在空气中自然干燥。样品如能放置在真空干燥箱内低真空干燥效果会更好。 H M D S 有毒 ,操作时应注意防护,样品自然干燥要在通风橱内进行。 样 品 的 导 电 处 理 生 物样品大多为不导电或导电不良体, S E M 观 察 时 易 产 生 「滞电 现 象 」而 「打火 」,从而影响对微细结构的观察。在观察前需要对样品进行导电处理,这样处理后的样品既能增强了其导电性能,又能增加样品发出二次电子的数量,以达到提高电 镜图像质量的目的。导电处理最常用的是离子镀膜法,又称离子溅射。在离子镀膜装置中,将样品放于正极,金 、铂等金属放在阴极,在 l〇-1—— l 〇-2Torr 特 殊 样 品 的 制 备 ⑴ 血 细 胞 : 先 在 lcmx0.5cm 的盖玻片上涂一层 1 % 的 Formvar 膜或血清,待干燥后将一滴血滴到盖玻片上,再用吸管轻轻地将血滴拨平。加 入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定lh, 0.075mol/LPBS 清洗 2 次 , IOmin/次 , 1 % O s 0 4 固定 30 min,蒸馏水洗 lOmin。之后 ( 2 ) 培 养 细 胞 :先 将 细 胞 在 Icm x lcm 大 小 的 盖 玻 片 上 培 养 ,停 止 培 养 后 ,用0.075mol/L PBS 漂洗,加 入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定 lh 。之后步骤同常规样品制备 (图2.3)
|
---|
实验步骤 |
免 疫 电 镜 胶 体 金 标 记 技 术 免疫电镜技术是利用抗原抗体特异性结合的原理,在细胞超微结构水平上定位、定性和定量,原位显示抗原大分子的技术。 1971 年 Faulk 等将胶体金标记抗体技术应用到电镜中,开始了免疫电镜胶体金标记技术。该技术的优点是:胶体金颗粒致密,易于辨认 ;定位比酶标记反应物更精确,同时还可以做定量分析;由于金颗粒直径的不同 (适合电镜的金颗粒直径为 5——10n m ),可以在同一切片上分别标记不同的抗体以做双标记或多标记。免疫电镜胶体金标记技术还可以用到冷冻超薄切片、冷冻置换、冷冻蚀刻和扫描 免疫电镜胶体金标记法可以分成包埋前标记法和包埋后标记法。前者由于金颗粒较大 ,对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面的抗原表面标记。如果要做细胞内细胞器的定位标记,可 以 用 Triton X -IOO 等活性剂给细胞膜打洞,但是活性剂会破坏细胞的超微结构。目前国外已成功制备了 I n m 金标记的探针,该探针可以穿透组织和细胞,这样就可以标记细胞内抗原。后者主要是进行细胞器的定位标记。包埋前标记法,即样品 包埋后免疫胶体金标记步骤: (1) 将 70n m 超薄切片收集到 3 0 0 目附有 Formvar 支持膜的镍网上。 (2) 准备一个培养皿,内放一张 Parafilm 薄膜。滴 一 滴 8 % 高碘酸溶液在 Parafilm 薄膜 上 ,然后将带有切片的镇网轻轻浮在液面上 (有切片的一面向下)10〜20 min,以达到去锇酸和增进树脂穿透性的目的。 ⑶ 用 0.01m 〇 l/L PBS(pH7. 4) 清洗 3 次 , 5 min/次,用滤纸吸掉多余的液体。 ⑷ 将 镇 网 浮 于 o. 5% B S A (p H 7. 4) 液滴上 2 〇 min (5) 切片在适当稀释的—抗中孵育, 4℃ 、 24〜 36 h (6) 漂洗同步骤⑶。 (7) 适当稀释胶体金标探针 (可以是二抗_胶体金、40——6dmino 、 蛋 白 A -胶体金等),室温下孵育 (8) 漂洗同步骤 (6)。 (9) 蒸溜水漂洗 3 次 , 5 min/次。 (10) 常规醋酸铀、柠檬酸铅染色。 (11) 电镜下观察。
|
---|
实验步骤 |
流 式 细 胞 仪 检 测 分 析 技 术实 验 材 料(1) 不同来源的干细胞,细胞数不少于 5xl0 5 个/管。 (2) 荧光标记的抗体或抗体及荧光二抗。 (3)PBS。 实 验 步 骤(1) 将 细 胞 用 PBS 充分洗涤后重悬于 5000 PBS 中,如果细胞收集和鉴定不能同天完成,可将充分洗涤后的细胞重悬于 Iml 80% 乙醇中,置-20¾ 保存待用。 (2) 按比例加入突光标记的抗体或先后分别加入无荣光标记的一抗及突光二抗,避光 4 ℃ 孵 育 30〜 60 min。 (3) 充分洗涤,至 少 3 次 ,减少非特异性标记。 (4) 上机检测,分析结果。
|
---|
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价