估计含噬菌粒单链拷贝的病毒颗粒的得率。先将上清稀释后感染大肠杆菌 DH11S,然后铺于含氨芐青霉素(60 μg/ml)的 YT 琼脂平板。根据 37℃ 培养 24 h 后产生的氨芐青霉素抗性克隆数,计算上清中含噬菌粒单链 DNA 的病毒颗粒数,含 2 X 1011~ 5 X 1011 pfu/ml 的上清可以获得满意的纯化噬菌粒单链 DNA 得率。
12. 在每个噬菌粒 DNA 样品中加入 5 μl 加样缓冲液,混合后加至 0.7% 琼脂糖凝胶的加样孔。
13. 6 V/cm 电泳数小时,至溴酚蓝迁移至胶的大约一半。在紫外线下检査和照相。
得率随噬菌粒上外源 DNA 的大小和持性的不同而不同。但通常为约 1 μg/ml 培养物。
14. 从含大置单链 DNA 的上清中分离噬菌粒单链 DNA。按方案“M13 噬菌体单链 DNA 的制备”的步骤进行,将体积放大 2~3 倍。
噬菌粒和 M13 噬菌体载体一样,随外源 DNA 的大小和特性不同,其单链 DNA 的得率可以差五至十倍。 通常片段越大,得率越低。而且,即使外源 DNA 大小相同,其单链 DNA 的得率也可以有很大变化,如,大多数酵母 DNA 片段对噬菌粒的增殖,似乎没有问题,然而同样大小的人基因组 DNA 可能使单链 DNA 的得率令人失望。噬菌粒上外源 DNA 的插入方向和噬菌体 DNA 复制起点的方向也会对得率产生重要影响。因此,用相反方向重新克隆片段或换用噬菌体 DNA 复制起点方向相反的载体有时可以解决得率低的问题。