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ELISA实验

标签: ELISA

酶联免疫吸附实验(ELISA)可以用于:(1)检测大分子抗原和特异性抗体等;(2)具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

详细
实验方法
  • ELISA实验
实验方法原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原,使抗原浓度为10-20 μg/ml,加100 μl/孔到96 孔酶标板,4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后,用PBST 洗涤3 次,每孔加入150 μl 1% BSA 37℃封闭1 小时。

3. PBST 洗涤3 次后,每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37℃孵育2 小时。

4. PBST 洗涤5 次后,加入100μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

5. PBST 洗涤5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。

二、包被细胞 

1. 在96 孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well,37℃过夜培养。

2. 第二天用PBS 洗涤培养板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin(1:10 稀释), 室温下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗涤培养板3 次,并晾干,储藏在2-8℃备用。

5. 用PBST 洗涤3 次,每孔加入150 μl 1% BSA 37℃封闭1 小时。

6. PBST 洗涤3 次后,每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37℃孵育2 小时。

7. PBST 洗涤5 次后,加入100 μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

8. PBST 洗涤5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃,保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至100 ml。                                                                                                                    


ABTS 作为底物进行显色反应(10ml):

 0.2M Na2HPO4 2.4ml

 0.1M 柠檬酸2.6ml

ddH2O 5ml

ABTS 5mg

H2O2(30%) 4 ul(用前加入)

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注意事项
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。
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其他
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
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