(6) 弃上清,吸取少量 SR 透析缓冲液(含 20 mmol/L MgCl2)至离心管中用以清洗沉淀物。注意少量,能够覆盖沉淀即可,尽量去除清洗缓冲液,可以短暂离心以保证清冼缓冲液集中于管底并完全去除。
(7) 将沉淀重悬于缓冲液 D 中,对于 Corex 离心管中的沉淀,吸取 200~400 μl 缓冲液 D 并轻轻上下吹打,注意吹打动作要轻以免样品损失。将重悬的沉淀转移到硅化的微量离心管中,再用 100 μl 缓冲液 D 冲洗离心管,将洗液并入微量离心管中。对于微量离心管中的沉淀,每毫升 65%~90% 透析过的硫酸铵组分所得沉淀加入 20~100 μl 缓冲液 D,注意不要上下吹打沉淀物。在以上两种情况下,将微量离心管置于 4°C 杯角超声浴中,将杯角探头的功率设置到最大值,超声 30 s,如有必要可重复几次,注意保持超声浴为 4℃。
(8) 重悬的 SR 蛋白的纯度可以通过 SDS PAGE 胶电泳分析,将同一蛋白的考马斯亮蓝染色结果与 mAb104 抗体免疫印迹结果相比较以进行鉴定。根据经验,银染方法不适于检测 SR 蛋白。
3. 单一 SR 蛋白的 SDS-PAGE 纯化和复性
(1) 用 0.75 mm 厚的边条,制备 5~8 cm 宽、4 cm 高的 10% 浓缩胶制备性凝胶,待凝胶聚合数小时后再使用。
(2) 在经镁离子沉淀并重悬于缓冲液 D 的 SR 蛋白溶液中加入等量 2X 蛋白上样缓冲液。对于上面所说的制备性凝胶,从 100 g 小牛胸腺所得的 SR 蛋白量可以取得最好的回收效果。应该注意在重悬时使样品保持较小的体积,同时不要直接用蛋白上样缓冲液重悬沉淀或在用于镁离子沉淀蛋白管中加入上样缓冲液。