体外转录反应完后,应用 DNA 酶 I 可以把 DNA 模板切除去,这样可以获得高敏感性的 RNA 探针。具有生物活性的 RNA 样品也要求去除 DNA 模板,这时保持 RNA 的完整性是关键的,故 DNase 为不含 RNA 酶的 DNA 酶,它可以有效地去除 DNA 而维持新合成的 RNA 的完整性。
1) 在体外转录体系内加入 DNA 酶,终浓度为 1U/ug 模板 DNA。
2) 于 37℃ 孵育 15 min
3) 用 TE-饱和的酚:氯仿:异戊醇(25:24:l,pH4.5) 抽提蛋白. 涡旋振荡 lmin,12000 g 离心
4) 将上层水相转移到新的离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋振荡 lmin,12000 g 离心
5) 将上层水相转移到新的离心管中,可以取少量进行变性胶电泳分析,剩佘的进一步沉淀回收
4. 沉淀回收转录 RNA 产物
1) 加入 0.5 倍体积的 7,5mol/L 乙酸铵。
2) 加 2.5 倍体积的无水乙醇,混合后置于一 70℃30mim。
3)12000 g 离心 5 min,小心去除清。
4) 沉淀用 1 ml70% 的乙醇洗涤,干燥,然后溶于 10〜20ul 的 TE 缓冲液或水中,存于一 70℃。